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原文传递一种用于检测端粒酶活性的电化学传感器及其检测方法

专利名称：	一种用于检测端粒酶活性的电化学传感器及其检测方法
摘要：	本发明基于功能化的纳米磁珠和核酸外切酶III辅助的放大策略构建了一种用于检测端粒酶活性的电化学传感器及其检测方法，实现了对肿瘤细胞端粒酶活性的检测。在本发明中，互补的探针可以与延长的端粒酶引物重复序列杂交，杂交产物通过磁珠分离，端粒酶引物重复序列链被核酸外切酶Ⅲ识别和降解，释放的互补探针能够杂交并打开多个亚甲基蓝标记的发夹DNA探针，经过核酸外切酶III的二次降解后，互补探针又可以进入下一个与MB标记的发夹样结构杂交的循环，而MB标记的探针与金电极表面的捕获探针结合，从而产生与端粒酶活性呈正比的峰电流值，本发明的电化学传感器及其检测方法能够在单细胞水平检测端粒酶活性。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	江苏;32
申请人：	南京市第二医院
发明人：	李金龙;杨永峰;张永臣;许传军;胡凯
专利状态：	有效
申请日期：	2019-06-12T00:00:00+0800
发布日期：	2019-09-17T00:00:00+0800
申请号：	CN201910506850.1
公开号：	CN110243905A
代理机构：	南京瑞弘专利商标事务所(普通合伙)
代理人：	冯慧
分类号：	G01N27/327(2006.01);G;G01;G01N;G01N27
申请人地址：	210003 江苏省南京市钟阜路1号—1
主权项：	1.一组用于检测端粒酶活性的探针，其特征在于，具体序列如下：端粒酶底物(TS)引物,SEQ ID NO.1： 5′-NH3-TTTTTTTTTTAATCCGTCGAGCAGAGTT-3′；发夹样探针(HP)，SEQ ID NO.2：5′-MB- TTTGTACCCTTTTGTGAGTTGGTTAGGGTTAGGG-3′；捕获探针(DNA S1)，SEQ ID NO.3：5′-GGTACATT-SH-3′；互补探针，SEQ ID NO.4：5′-CCCTAACCCTAA-3′。 2.一种用于检测端粒酶活性的电化学传感器的制备方法，其特征在于，包含以下步骤： (1)细胞培养及端粒酶的提取； (2)金电极处理和DNA的固定； (3)端粒酶活性的电化学检测。 3.如权利要求2所述的一种制备方法，其中步骤(1)细胞培养及端粒酶的提取，具体步骤如下： 1)HeLa细胞培养； 2)细胞悬浮分散处理：将处在对数生长期的细胞用PBS洗涤，用胰蛋白酶消化1-3min后，再用PBS缓冲液吹打细胞，使其脱离，制得脱壁细胞； 3)端粒酶提取：收集步骤(2)制得的脱壁细胞，离心、重悬并冰浴10-50min，将含有细胞的裂解液在4℃的温度下离心，收集上清液，测定蛋白浓度，所提取物立即使用或储存在-80℃。 4.如权利要求2所述的一种制备方法，其中步骤(2)金电极处理和DNA的固定，具体步骤如下： 1)金电极预处理： a)金电极用氧化铝粉末抛光，得到抛光后的电极； b)将步骤2-a)中抛光后的电极浸泡在水虎鱼溶液[V(H2SO4)：(30％H2O2)＝3：1]中2-20min消除吸附的有机物，并用去离子水彻底清洗； c)再将电极用50％硝酸浸泡10-30min，然后分别用乙醇和去离子水处理电极2-8min，再用氮气吹干后，将电极浸入0.5M硫酸中，用循环伏安法(CV)从0到1.6V进行扫描直到获得稳定的信号； 2)将含巯基标记捕获探针的DNA固定化缓冲液滴加在金电极表面，在潮湿条件下孵育8-16h，捕获探针一端的巯基通过Au-S键连接到金电极表面，然后对修饰的金电极进行冲洗，在电极表面滴入含1mM MCH的Tris-HCl，孵育8-20min； 3)将没有被捕获探针结合的金电极表面封闭起来，以形成良好的无非特异性吸附的自组装单分子层。 5.如权利要求2所述的一种制备方法，其中步骤(3)端粒酶活性的电化学检测，具体步骤如下： 1)将10μL端粒酶提取物添加到40μL含有2mM互补探针的延伸溶液中，在37℃反应2h，制得磁珠-DNA复合物； 2)将步骤1)制得的磁珠-DNA复合物收集，用PBS冲洗，然后加入反应缓冲液，重悬磁珠(MB)-DNA复合物，并加入发夹样探针(HP)，核酸外切酶III(Exonuclease III,Exo III)，在25℃孵育20-60min，制得混合物； 3)将步骤2)制得的混合物与捕获探针修饰的金电极共孵育1-4h，之后彻底清洗去除多余的DNA，制得电化学传感器，即可对端粒酶活性进行电化学检测。 6.如权利要求2-3任意一项所述的一种制备方法，其特征在于：步骤1)中，HeLa细胞培养的条件为：37℃，5％CO2培养条件下用含有10％胎牛血清的DMEM培养基培养；步骤3)中，首次离心为1000rpm离心5min；步骤3)中，冰浴时间为30min；步骤3)中，第二次离心为12000rpm离心30min；步骤3)中，用200μL冰冻的1×CHAPS裂解缓冲液重悬；步骤3)中，用Eppendorf管收集上清液。 7.如权利要求2和权利要求4任意一项所述的一种制备方法，其特征在于：步骤1)-a)中，氧化铝粉末的粒子大小为1.0、0.3和0.05μm；步骤2)中，用1μM的巯基标记捕获探针；步骤2)中，在潮湿条件下孵育12h；步骤2)中，在电极表面滴入含1mM MCH的10μL Tris-HCl(10mM)，孵育15min。 8.如权利要求2和权利要求5任意一项所述的一种制备方法，其特征在于：步骤1)中延伸液的成分为：20mM Tris-HCl,pH 8.3,1.5mM MgCl2,63mM KCl,0.005％Tween 20,1mM EGTA,0.1mg·mL-1 BSA,1mM dNTP和0.5μM磁珠-Primer；步骤1)中，提取物和延伸液的体积比为1:4；步骤2)中，反应缓冲液为：40mM的Tris-HCl,50mM NaCl,10mM MgCl2,pH 7.9；步骤2)中，用量为2μM发夹样探针(HP)，12.5个单位的核酸外切酶III；步骤2)中，孵育时间为40min；步骤3)中，孵育条件为37℃，孵育2h。 9.一种检测端粒酶活性的方法，其特征在于，包含权利要求1所述的探针和权利要求2所述的电化学传感器的制备方法；所用的电化学方法包括交流阻抗法(EIS)和差分脉冲伏安法(DPV)；电化学仪器为CHI660D，包括三电极系统，Ag/AgCl为参比电极，和铂丝作为辅助电极和修饰了DNA的金电极为工作电极；交流阻抗法(EIS)是在含1M KNO3的5mM[Fe(CN)6]3-/4-的溶液进行，EIS实验参数：起始电压为0.224V，扫描频率为0.1Hz-100kHz； DPV在10mM PBS buffer(PH 7.4)中进行，DPV实验参数：扫描电压为-0.5V-0V，脉冲幅度为50mV；电化学测试均在室温下进行。 10.如权利要求1所述的探针和权利要求9所述的检测端粒酶活性的方法在检测端粒酶活性中的应用。
所属类别：	发明专利