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原文传递致病性念珠菌检测和鉴定方法

专利名称：	致病性念珠菌检测和鉴定方法
摘要：	本发明提供了一种致病性念珠菌检测和鉴定方法，具体为：以致病性念珠菌分泌的特异性烯醇化酶作为检测靶标分子，采用基因工程和细胞工程技术生产念珠菌特异性烯醇化酶的单克隆抗体、标记物和包被载体，通过双抗体夹心法对致病性念珠菌进行检测和鉴定。本发明还提供了致病性念珠菌检测和鉴定卡及其制备方法。本发明首次实现了对致病性念珠菌分离鉴定，采用白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌和光滑念珠菌烯醇化酶的通用抗体作为标记物，使4种细菌能在同一检测和鉴定卡上检测出来，省去依次单一盲测确定何种菌株的感染的麻烦，方便经济。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	河南;41
申请人：	河南美凯生物科技有限公司
发明人：	赵焕朝;陈兴;栗克文;郭凯;胡晶洁
专利状态：	有效
申请日期：	2019-07-31T00:00:00+0800
发布日期：	2019-09-17T00:00:00+0800
申请号：	CN201910700999.3
公开号：	CN110244049A
代理机构：	郑州博派知识产权代理事务所(特殊普通合伙)
代理人：	荣永辉
分类号：	G01N33/577(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	462000 河南省漯河市源汇区创业路与南环路西北角
主权项：	1.一种致病性念珠菌检测和鉴定方法，其特征在于，以致病性念珠菌分泌的特异性烯醇化酶作为检测靶标分子，采用基因工程和细胞工程技术生产念珠菌特异性烯醇化酶的单克隆抗体、标记物和包被载体，通过双抗体夹心法对致病性念珠菌进行检测和鉴定。 2.根据权利要求1所述的致病性念珠菌检测和鉴定方法，其特征在于，所述致病性念珠菌包括白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌和光滑念珠菌。 3.根据权利要求2所述的致病性念珠菌检测和鉴定方法，其特征在于，所述念珠菌特异性烯醇化酶的单克隆抗体中白色念珠菌分泌的特异性烯醇化酶对应特异性单克隆抗体A，热带念珠菌分泌的特异性烯醇化酶对应特异性单克隆抗体B，近平滑念珠菌分泌的特异性烯醇化酶对应特异性单克隆抗体C，光滑念珠菌分泌的特异性烯醇化酶对应特异性单克隆抗体D，专一的单克隆抗体与其它烯醇化酶无交叉反应；所述白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌和光滑念珠菌分泌的特异性烯醇化酶都对应特异性单克隆抗体E。 4.一种根据权利要求1~3任一所述致病性念珠菌检测和鉴定方法的致病性念珠菌检测和鉴定卡，其特征在于，包括卡壳和试纸条，卡壳分为上下两片，用于固定试纸条，上片有镂空的观察窗和加样孔，所述加样孔内侧用无纺布滤布覆盖粘接；试纸条包括样本处理垫、标记物垫、硝酸纤维素膜和吸水纸。 5.根据权利要求4所述的致病性念珠菌检测和鉴定卡，其特征在于，所述试纸条样本垫为玻璃纤维纸，用PBST-EDTA缓冲液浸润后烘干得到。 6.根据权利要求4所述的致病性念珠菌检测和鉴定卡，其特征在于，所述无纺布滤布目数为100～300。 7.根据权利要求4所述的致病性念珠菌检测和鉴定卡，其特征在于，所述试纸条标记物垫，使用标记物标记单克隆抗体E，均匀喷涂在硝酸纤维素膜上，烘干得到；所述标记物包括但不局限于胶体金、过氧化物酶、吖啶酯、碱性磷酸酶、乳胶微球或荧光物质。 8.根据权利要求4所述的致病性念珠菌检测和鉴定卡，其特征在于，所述试纸条硝酸纤维素膜上分别包被单克隆抗体A、B、C、D和羊抗鼠质控抗体；包被载体如硝酸纤维素膜上待包被抗体加入与标记抗体颜色不同的色素，使包被过硝酸纤维素膜上的条线清晰易见。 9.一种根据权利要求4~8任一所述的致病性念珠菌检测和鉴定卡的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：步骤一、将标记物标记的单克隆抗体E分别用含30%BSA的PBS缓冲液稀释浓度为0.1～1mg/mL制成标记液，喷到玻璃纤维纸上作为标记物垫；步骤二、将单克隆抗体A、B、C和D分别用含30%BSA的PBS缓冲液稀释浓度为0.1～1 mg/mL制成包被液，并分别加入0.1 mg/mL的日落黄，按顺序用划膜仪依次从左至右包被到硝酸纤维素膜作为4条检测线；将羊抗鼠抗体用同样的PBS缓冲液稀释至1mg/mL，并加入0.1 mg/mL的日落黄，用划膜仪包被到D线右侧的硝酸纤维素膜上作为质控线，干燥后硝酸纤维素膜上会有5条浅黄色的条带；步骤三、将玻璃纤维纸用0.01～0.1 mol/mL的PBST-EDTA缓冲液（pH=7.2）浸润，浸润后的玻璃纤维纸使用恒温鼓风干燥箱烘干，作为样品垫；步骤四、试纸条组装，依次将样品垫、标记物垫、硝酸纤维素膜和吸水纸组装到PVC底板上再切条即可；步骤五、在卡壳上盖，加样孔内侧用防水快干胶粘上一层无纺布滤布，无纺布能够完全覆盖加样孔；步骤六、将试纸条放入卡壳，加样孔对准样品垫，观察窗对准试纸条上硝酸纤维素膜，把上下卡壳压紧即可。
所属类别：	发明专利