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原文传递一种用于检测复杂体系中凝血因子FXIa抑制剂活性的荧光探针及其应用

专利名称：	一种用于检测复杂体系中凝血因子FXIa抑制剂活性的荧光探针及其应用
摘要：	本发明公开了一种用于检测复杂体系中凝血因子FXIa抑制剂活性的荧光探针及其应用。所述荧光探针包括识别探针和捕获探针；所述识别探针由荧光量子点，以及分别修饰在荧光量子点上的肠激酶和适配体构成；所述捕获探针由纳米磁球以及共价修饰在纳米磁球上的FXIa构成；所述适配体与FXIa活性位点的结合亲和力低于FXIa抑制剂与FXIa活性位点的结合亲和力。本发明方法的开发为复杂体系中FXIa抑制剂活性成分的高灵敏的发现、高通量定量分析及高内涵活性筛选提供了关键技术手段，在新型抗凝肽的药物研究及中药复杂体系中FXIa抑制剂的活性成分筛选研究中具有一定的应用价值。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	江苏;32
申请人：	中国药科大学
发明人：	舒畅;胡鹏辉;詹玉娟;包兴艳
专利状态：	有效
申请日期：	2023-08-11T00:00:00+0800
发布日期：	2023-11-10T00:00:00+0800
申请号：	CN202311009243.7
公开号：	CN117030672A
代理机构：	南京苏高专利商标事务所(普通合伙)
代理人：	刘红阳
分类号：	G01N21/64;G01N33/86;G01N33/58;C12Q1/37;G;C;G01;C12;G01N;C12Q;G01N21;G01N33;C12Q1;G01N21/64;G01N33/86;G01N33/58;C12Q1/37
申请人地址：	211198 江苏省南京市龙眠大道639号
主权项：	1.一种用于检测复杂体系中凝血因子FXIa抑制剂活性的荧光探针，其特征在于，所述荧光探针包括识别探针和捕获探针；所述识别探针由荧光量子点，以及分别修饰在荧光量子点上的肠激酶和适配体构成；所述捕获探针由纳米磁球以及共价修饰在纳米磁球上的FXIa构成；所述适配体与FXIa活性位点的结合亲和力低于FXIa抑制剂与FXIa活性位点的结合亲和力。 2.根据权利要求1所述的用于检测复杂体系中凝血因子FXIa抑制剂活性的荧光探针，其特征在于，所述识别探针为AptE40-QDs-EK，其中，所述肠激酶为重组人肠激酶，所述荧光量子点为ZnSe@ZnS量子点，所述适配体为AptE40。 3.根据权利要求2所述的用于检测复杂体系中凝血因子FXIa抑制剂活性的荧光探针，其特征在于，所述AptE40-QDs-EK的制备方法为： ZnSe@ZnS分散液、AptE40、重组人肠激酶、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐在缓冲溶液中混合，孵育一段时间；孵育结束后，收集沉淀，所述沉淀即为AptE40-QDs-EK。 4.根据权利要求1所述的用于检测复杂体系中凝血因子FXIa抑制剂活性的荧光探针，其特征在于，所述捕获探针为MNPs-FXIa，所述MNPs-FXIa的制备方法为： MNPs-COOH分散液、FXIa溶液、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐混合，然后在室温下反应一段时间，磁分离后得MNPs-FXIa。 5.根据权利要求1所述的用于检测复杂体系中凝血因子FXIa抑制剂活性的荧光探针，其特征在于，所述荧光探针还包括信号探针，所述信号探针为六聚精氨酸肽-CdTe@ZnS QDs复合物。 6.根据权利要求5所述的用于检测复杂体系中凝血因子FXIa抑制剂活性的荧光探针，其特征在于，六聚精氨酸肽-CdTe@ZnS QDs复合物的制备方法为：将六聚精氨酸肽溶液与CdTe@ZnS QDs溶液充分混合，收集产物，即为六聚精氨酸肽-CdTe@ZnS QDs复合物；其中六聚精氨酸肽溶液中的六聚精氨酸肽的质量与CdTe@ZnS QDs溶液中CdTe@ZnS的质量比为1-7:15。 7.一种复杂体系中凝血因子FXIa抑制剂活性的检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤： (1)识别探针分散液和捕获探针分散液混合形成第一复合物；第一复合物中加入样品，孵育一段时间，取上清液；在上清液中加入胰蛋白酶原和信号探针，孵育一段时间，孵育结束后，测定荧光强度，若样品中存在FXIa抑制剂，则测得的荧光信号可依次实现一级信号放大和二级信号放大，其中，荧光信号的恢复程度与FXIa抑制活性成分的含量相关联； (2)将步骤(1)中的样品依次替换为含有梯度浓度的FXIa抑制剂的样品，并重复步骤(1)若干次，得到FXIa抑制剂浓度与荧光信号的恢复程度对应的标准曲线； (3)使用步骤(1)中的方法测定待测样品的荧光信号的恢复程度，并与步骤(2)中得到的标准曲线比对，得到待测样品中FXIa抑制剂浓度。 8.根据权利要求6所述的复杂体系中凝血因子FXIa抑制剂活性的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，识别探针分散液中识别探针的质量与捕获探针分散液中捕获探针的质量比为1：1。 9.根据权利要求6所述的复杂体系中凝血因子FXIa抑制剂活性的检测方法，其特征在于，测定荧光强度的条件为：测定600nm荧光强度，激发波长为365nm。 10.一种复杂体系中凝血因子FXIa抑制活性的筛选方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤： (1)识别探针分散液和捕获探针分散液混合形成第一复合物；第一复合物中加入待筛选样品，孵育一段时间，取上清液；在上清液中加入胰蛋白酶原和信号探针，孵育一段时间，孵育结束后，测定荧光强度，测定的荧光强度记为F； (2)将步骤(1)中的第一复合物替换等体积的纯水，重复步骤(1)，测定的荧光强度记为F0； (3)将步骤(1)中，待筛选样品替换为阴性对照组，重复步骤(1)，测定的荧光强度记为Fm； (4)将步骤(1)中的第一复合物替换等体积的纯水，待筛选样品替换为阴性对照组，重复步骤(1)，测定的荧光强度记为F1； (5)评估待筛选样品对FXIa抑制能力的指标n的计算公式如下：