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原文传递一种间接检测甲基嘧啶磷的酶联免疫吸附分析方法

专利名称：	一种间接检测甲基嘧啶磷的酶联免疫吸附分析方法
摘要：	本发明涉及免疫检测技术领域，公开了一种间接检测甲基嘧啶磷的酶联免疫吸附分析方法，包括以下步骤，步骤一：稀释包被抗原，包被在酶标板微孔内孵孕过夜，步骤二：加入100ul的甲基嘧啶磷样品液和100ul封闭液，封闭，步骤三：弃去封闭液，用洗涤缓冲液洗板三次；步骤四：稀释待检抗体，加入100ul稀释后的待检抗体孵孕，洗板三次，步骤五：加入100ul酶标二抗孵孕，步骤六：加入100ul显色液进行室温避光显色，随后加入终止液终止反应；步骤七：读取吸光度值，换算甲基嘧啶磷的实际含量。本发明通过采用2‑二乙基氨基‑6‑甲基‑4‑羟基嘧啶醇偶联小鼠血清蛋白作为包被抗原，降低了反应体系的碱度，提高检测灵敏度和精度，操作简单，成本低廉。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	江西;36
申请人：	海利贵溪新材料科技有限公司
发明人：	刘仁智;汪爱春;毛林生;朱孝卫;乐红卫;邵剑;丁开良;李龙水;吴锋;叶小华
专利状态：	有效
申请日期：	2023-06-27T00:00:00+0800
发布日期：	2023-11-10T00:00:00+0800
申请号：	CN202310765862.2
公开号：	CN117031006A
代理机构：	鹰潭市智埠专利代理事务所(普通合伙)
代理人：	李水娣
分类号：	G01N33/543;G01N33/53;G;G01;G01N;G01N33;G01N33/543;G01N33/53
申请人地址：	335400 江西省鹰潭市贵溪市硫磷化工基地纪七路以西、纬七路以北
主权项：	1.一种间接检测甲基嘧啶磷的酶联免疫吸附分析方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：将包被抗原用包被液稀释，包被在聚苯乙烯酶标板的微孔内，每孔100ul，在4℃条件下孵孕过夜；步骤二：弃去包被液，在酶标板微孔内加入100ul的甲基嘧啶磷样品液和100ul封闭液，封闭；步骤三：弃去封闭液，用洗涤缓冲液洗板三次；步骤四：利用稀释液稀释待检抗体，在酶标板的微孔内加入100ul稀释后的待检抗体孵孕，洗板三次；步骤五：在酶标板微孔内加入100ul酶标二抗孵孕；步骤六：在酶标板微孔内加入100ul显色液进行室温避光显色，随后加入终止液终止反应；步骤七：利用酶标仪读取吸光度值，根据颜色反应程度进行包被抗原的定性和定量测定，换算甲基嘧啶磷的实际含量。 2.根据权利要求1所述的一种间接检测甲基嘧啶磷的酶联免疫吸附分析方法，其特征在于，所述步骤一中包被抗原为2-二乙氨基-6-甲基-4-羟基嘧啶醇偶联小鼠血清蛋白，所述包被液为pH9.6的碳酸盐缓冲液，所述稀释比例为1:5000。 3.根据权利要求2所述的一种间接检测甲基嘧啶磷的酶联免疫吸附分析方法，其特征在于，所述2-二乙氨基-6-甲基-4-羟基嘧啶醇的制备方法为将硝酸二乙胍、乙醇和氢氧化钾加入反应釜中，室温下搅拌2h进行反应，产物过滤，滤液脱溶，釜底残留物为二乙胍，随后加入甲苯、乙酰乙酸乙酯，再回流反应1-2h，反应结束后脱去溶剂，得到2-二乙氨基-6-甲基-4-羟基嘧啶醇，所述硝酸二乙胍、乙醇、氢氧化钾、甲苯和乙酰乙酸乙酯按质量份数的组份比为1：1.5：0.4：1.7：2.2。 4.根据权利要求1所述的一种间接检测甲基嘧啶磷的酶联免疫吸附分析方法，其特征在于，所述步骤二中封闭液为浓度5％的脱脂奶粉，所述封闭温度为37℃，封闭时间为20min。 5.根据权利要求1所述的一种间接检测甲基嘧啶磷的酶联免疫吸附分析方法，其特征在于，所述步骤三中洗涤缓冲液为PSB与0.1％浓度的吐温20混合液。 6.根据权利要求1所述的一种间接检测甲基嘧啶磷的酶联免疫吸附分析方法，其特征在于，所述步骤四中稀释液为PSB与去离子水的混合液，pH值为7.4，所述稀释比例为1:5000，所述待检抗体为兔抗小鼠IgG，所述孵孕时间为20min，孵孕为温度37℃。 7.根据权利要求1所述的一种间接检测甲基嘧啶磷的酶联免疫吸附分析方法，其特征在于，所述步骤五中酶标二抗为HRP驴抗兔IgG血清，所述孵孕时间为20min，孵孕为温度37℃。 8.根据权利要求1所述的一种间接检测甲基嘧啶磷的酶联免疫吸附分析方法，其特征在于，所述步骤六中显色液为TMB显色液，所述显色时间为5-10min，所述终止液为2M硫酸，用量为50ul/孔。