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原文传递肝血管肉瘤标志物的筛选方法及其在制备肝血管肉瘤诊断试剂盒中的应用

专利名称：	肝血管肉瘤标志物的筛选方法及其在制备肝血管肉瘤诊断试剂盒中的应用
摘要：	本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种肝血管肉瘤标志物的筛选方法及其在制备肝血管肉瘤诊断试剂盒中的应用。一种肝血管肉瘤标志物的筛选方法，包括如下步骤：将血液样本解冻后清洗，匀浆，涡旋，加入甲醇和乙腈溶液，涡旋，超声，孵育后，离心，冷冻干燥；将冻干粉复溶后，采用超高效液相色谱分离，采用质谱仪I进行检测分析；检测完毕后，采用质谱仪II鉴定分子产物，同时采集血液样品的一级质谱谱图和二级质谱谱图；根据OPLS‑DA模型，以VIP>1为筛选标准，初步筛选；采用多维度统计分析，选择VIP>1、Fold change>2或<0.5的分子产物作为具有显著性差异的蛋白质。本发明通过液相色谱串联质谱分析检测出的分子标志物可以为日后的肝血管肉瘤药物的研发提供新的治疗靶点和思路。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	河南;41
申请人：	郑州大学第一附属医院
发明人：	何玉婷;薛晨
专利状态：	有效
申请日期：	2023-08-23T00:00:00+0800
发布日期：	2023-11-24T00:00:00+0800
申请号：	CN202311064762.3
公开号：	CN117110474A
代理机构：	郑州豫开专利代理事务所(普通合伙)
代理人：	朱俊峰
分类号：	G01N30/02;G01N30/06;G01N30/72;G01N30/86;G;G01;G01N;G01N30;G01N30/02;G01N30/06;G01N30/72;G01N30/86
申请人地址：	450000 河南省郑州市二七区建设东路50号
主权项：	1.一种肝血管肉瘤标志物的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤： (1)提取分子产物，将保存于-80℃下的血液样本解冻后，采用4℃下的PBS清洗，然后，加入ddH2O进行匀浆，涡旋，加入甲醇和乙腈溶液，涡旋，超声，再置于-20℃下孵育后，4℃下离心，将上清真空冷冻干燥，最后，将冻干粉置于-80℃下保存，备用； (2)LC-MS/MS质谱分析，将上述冻干粉用体积比为1:1的乙腈和水溶液复溶后，采用超高效液相色谱系统分离，然后采用质谱仪I进行检测分析； (3)数据处理，样本检测完毕后，采用质谱仪II鉴定分子产物，同时采集血液样品的一级质谱谱图和二级质谱谱图； (4)统计学分析，根据OPLS-DA模型，以VIP>1为筛选标准，初步筛选出差异分子产物；然后，采用多维度统计分析方法，选择VIP>1、Fold change>2或<0.5的分子产物作为具有显著性差异的蛋白质。 2.根据权利要求1所述的肝血管肉瘤标志物的筛选方法，其特征在于，步骤(2)中，所述超高效液相色谱的参数设置为：柱温为25℃、流速为0.3mL/min、上样量为2μL；流动相由两相组成，其中，流动相A为含有25mM乙酸铵和25mM氨水的水溶液，流动相B为纯乙腈；样品采用梯度洗脱的方式进行洗脱，洗脱程序为：0～0.5min，95％B；0.5～7min，95％B～65％B；7～8min，65％B～50％B；8～9min，50％B；9～9.1min，50％B～95％B；9.1～12min，95％B；上述过程中样品均置于4℃下。 3.根据权利要求1所述的肝血管肉瘤标志物的筛选方法，其特征在于，步骤(2)中，所述质谱仪I在ESI正离子模式下进行，ESI源的参数设置为：Drying gas流速，16L/min；Gas温度，250℃；Sheath gas温度，500℃；sheath Gas流速，12L/min；Nebulizer，20psig；Vcap，3000V；Nozzle电压，175V；Mass Range，50～1200Da；Acquisition rate，4HZ；每个循环的时间，50ms。 4.根据权利要求1所述的肝血管肉瘤标志物的筛选方法，其特征在于，步骤(3)中，所述质谱仪II的ESI源参数设置为：Ion Source Gas1，50；Ion Source Gas2，80；sourcetemperature，650℃；Curtaingas，30；Ion Sapary Voltage Floating±5000V，正离子模式；二级质谱IDA获得，采用高灵敏度模式进行采集，Declustering potential，±60V，正离子模式；Collision Energy；35±15eV；IDA的参数设置如下：Exclude isotopes within 4道尔顿，Candidate ions to monitor per cycle：10；采集数据的模式按照如下质核比进行分段，50～300m/z，290～600m/z，590～900m/z，890～1200m/z。 5.根据权利要求1所述的肝血管肉瘤标志物的筛选方法，其特征在于，步骤(3)中，经ProteoWizard将原始数据转换成.mzXML格式，然后采用lc-ms spectra annotation软件进行峰对齐、保留时间校正以及峰面积的提取，采用精确质量数匹配和二级谱图匹配的方式对小分子的结构进行鉴定。 6.根据权利要求1所述的肝血管肉瘤标志物的筛选方法，其特征在于，步骤(4)中，具有显著性差异的蛋白质为RAPGEF6蛋白质、Mcm7蛋白质、IDI1蛋白质和TOMM6蛋白质。 7.一种如权利要求1～6任一项所述的肝血管肉瘤标志物在制备肝血管肉瘤诊断试剂盒中的应用，所述肝血管肉瘤蛋白质标志物为RAPGEF6蛋白质、Mcm7蛋白质、IDI1蛋白质和TOMM6蛋白质。 8.根据权利要求7所述的肝血管肉瘤标志物在制备肝血管肉瘤诊断试剂盒中的应用，其特征在于，所述试剂盒中包括特异性检测RAPGEF6蛋白质、Mcm7蛋白质、IDI1蛋白质和TOMM6蛋白质的试剂。 9.根据权利要求7所述的肝血管肉瘤标志物在制备肝血管肉瘤诊断试剂盒中的应用，其特征在于，具体操作时，采用SPSS分别绘制RAPGEF6蛋白质、Mcm7蛋白质、IDI1蛋白质和TOMM6蛋白质的ROC曲线，其中，RAPGEF6蛋白质的cut off值为8734.77，Mcm7蛋白质的cutoff值为90796.54，IDI1蛋白质的cut off值为10155.52，TOMM6蛋白质的cut off值为47012.01。 10.一种如权利要求1～6任一项所述的肝血管肉瘤标志物作为靶标在筛选抗肝血管肉瘤药物中的应用，所述肝血管肉瘤蛋白质标志物为RAPGEF6蛋白质、Mcm7蛋白质、IDI1蛋白质和TOMM6蛋白质。
所属类别：	发明专利