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原文传递用于淫羊藿和补骨脂特异质肝损伤成分筛选的检定方法

专利名称：	用于淫羊藿和补骨脂特异质肝损伤成分筛选的检定方法
摘要：	本发明提供了一种用于淫羊藿和补骨脂特异质肝损伤成分筛选的检定方法，包括配制母液、配制稀释液、细胞给药后测定、动物实验验证和代谢组学分析的步骤。本发明对淫羊藿、补骨脂药材进行成分挖掘，发现了TNF‑α诱导的免疫应激、淫羊藿和补骨脂中免疫促进成分和肝损伤易感成分协同导致肝损伤。为淫羊藿和补骨脂配伍导致肝损伤的早期预警、诊断与治疗提供潜在生物学靶点，保障其临床安全合理用药。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	北京;11
申请人：	中国医学科学院肿瘤医院
发明人：	李春雨;李国辉;李蓥滢;曹波
专利状态：	有效
申请日期：	2023-06-21T00:00:00+0800
发布日期：	2023-11-03T00:00:00+0800
申请号：	CN202310742861.6
公开号：	CN116990469A
代理机构：	北京三聚阳光知识产权代理有限公司
代理人：	李红团
分类号：	G01N33/15;G01N1/28;G;G01;G01N;G01N33;G01N1;G01N33/15;G01N1/28
申请人地址：	100021 北京市朝阳区潘家园南里17号
主权项：	1.一种用于淫羊藿和补骨脂特异质肝损伤成分筛选的检定方法，所述方法的建立主要包括下述步骤： a.配制TNF-α、淫羊藿和补骨脂单体成分母液 TNF-α母液：取TNF-α粉末制备0.1mg/mL储备液；淫羊藿和补骨脂化学成分母液的制备：选定10种淫羊藿单体成分和11种补骨脂单体成分，精密称取各成分适量置于1.5mL灭菌的EP管中，用细胞级DMSO溶解，配置成母液，分装置于-80℃储存备用； b.配制TNF-α、淫羊藿和补骨脂单体成分稀释液取出TNF-α母液，避光室温放置2h，用纯DMEM培养基将其稀释备用；现用现取各单体成分母液，用纯DMEM培养基将其稀释为不同浓度的单体成分稀释液，备用； c.细胞给药及测定将肝细胞接种于96孔细胞培养板中，并在培养箱内培养；给药时吸出细胞培养液，提前向每孔加入适量TNF-α稀释液或其DMSO载体；一定时间后，向各孔中加入适量对应浓度的淫羊藿和/或补骨脂单体成分稀释液或其DMSO载体，放入培养箱内培养，之后吸取上清测定乳酸脱氢酶释放量，以此作为指标评价细胞毒性； d.动物实验验证采用小鼠建立TNF-α诱导的免疫特异质肝损伤模型：首先给予小鼠TNF-α溶液或其载体，一段时间后给予小鼠不同浓度的淫羊藿苷和/或补骨脂甲素或其载体，设定给药时间摘除小鼠眼球取血，并采用装有肝素钠的抗凝管收集离体血液，同时采集小鼠肝脏组织；测定小鼠血浆中谷丙转氨酶和乳酸脱氢酶含量，以ALT和LDH作为初步考察指标体内验证免疫促进成分和肝损伤易感成分协同诱导肝损伤； e.代谢组学分析肝组织样本处理后使用超高效液相色谱和串联质谱分析，将分析结果进一步做代谢组学分析。 2.根据权利要求1所述的检定方法，其中，在步骤a中：选定的10种淫羊藿单体成分，分别为淫羊藿苷、淫羊藿素、淫羊藿次苷Ⅰ、淫羊藿次苷Ⅱ、朝藿定A、朝藿定A1、朝藿定B、朝藿定C、脱水淫羊藿素和淫羊藿属苷A；选定的11种补骨脂单体成分，分别为补骨脂酚、补骨脂甲素、补骨脂苷、异补骨脂苷、补骨脂素、异补骨脂素、异补骨脂二氢黄酮、新补骨脂异黄酮、补骨脂二氢黄酮甲醚、补骨脂定和补骨脂乙素；淫羊藿单体成分和补骨脂单体成分的母液浓度均为50mg/mL；母液溶液贮存温度为-80℃。 3.根据权利要求1所述的检定方法，其中，在步骤b中：测定时，TNF-α稀释液浓度为10ng/mL；测定时，单体成分稀释液浓度为8.33-66.67μM；稀释液现用现配。 4.根据权利要求1所述的检定方法，其中，在步骤c包括：培养：细胞在培养箱内培养24小时后给药；预先刺激：吸出培养基，先向每孔加入100μL TNF-α稀释液或其DMSO载体DMEM，放入培养箱内孵育2h后给药；给药方式：直接向每孔中加入50μL对应浓度的淫羊藿和/或补骨脂单体成分稀释液或其DMSO载体；药物浓度：优选地，联合给药时，补骨脂甲素浓度为33.33μM，其余药物浓度范围为6.25-66.67μM；测定：给药后放入培养箱中孵育时间为24h；指标：测定乳酸脱氢酶LDH释放量，以此作为指标评价细胞毒性。 5.根据权利要求1所述的检定方法，其中，在步骤d中：选择18-20g BALB/C小鼠建立特异质肝损伤模型； TNF-α给药方式为尾静脉注射； TNF-α给药剂量为10μg/kg； TNF-α注射2h后再给予小鼠相应药物；淫羊藿次苷Ⅱ和补骨脂甲素用0.5％CMC-Na溶液配制；优选地，淫羊藿次苷Ⅱ给药浓度为25mg/kg，补骨脂甲素给药剂量为50mg/kg；给药方式为灌胃给药；给药后处死小鼠的时间为16h；以小鼠血浆中谷丙转氨酶和乳酸脱氢酶含量为测定指标。 6.根据权利要求1-3任一项所述的检定方法，其中，步骤c中的所述肝细胞为人正常肝细胞L02细胞系或人肝癌HepG2细胞系，优选地为人肝癌HepG2细胞系。 7.根据权利要求1-3任一项所述的特异质肝损伤成分筛选的检定方法，其中，步骤c中的细胞接种浓度为5×105～10×105个/mL，优选地，细胞接种浓度为9×105个/mL。 8.根据权利要求1-4任一项所述的检定方法，其中，步骤a-d中的诱导细胞或动物免疫应激的物质为TNF-α。 9.根据权利要求1-3任一项所述的检定方法，其中，步骤c中所述细胞培养液由DMEM培养基、胎牛血清和10000U/ml的青链霉素混合液配置而成，优选地，所述细胞培养液中的DMEM培养基、胎牛血清和10000U/ml的青链霉素的体积百分数分别为89％、10％和1％。
所属类别：	发明专利