详情

原文传递一种用于检测猫冠状病毒抗体的间接ELISA试剂盒及其应用

专利名称：	一种用于检测猫冠状病毒抗体的间接ELISA试剂盒及其应用
摘要：	本发明公开了一种用于检测猫冠状病毒抗体的间接ELISA试剂盒及其应用，所述试剂盒中含有包被抗原M重组蛋白；M重组蛋白的氨基酸序列如SEQ.ID NO:1所示。截短后的M蛋白的各毒株彼此间的核酸同源率为92.6～100％，相应氨基酸同源率为98.35～100％，在FCoV两种血清型之间同源率为85.89％～87.77％，所以本发明建立的间接ELISA方法能够同时检测到FCoV的两种血清型。该试剂盒采用间接ELISA用于检测感染猫冠状病毒抗体，可用于预防性检测宠物猫中的FCoV，从根源上防治FIPV，减少宠物猫的致死率；同时猫做为重要的实验动物，该技术可用于如SARS‑CoV2的猫感染模型中排除FCoV的感染。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	四川;51
申请人：	四川农业大学
发明人：	罗启慧;杜彦妮;陈正礼;黄超;刘文涛;贾兰兰
专利状态：	有效
申请日期：	2023-07-03T00:00:00+0800
发布日期：	2023-11-10T00:00:00+0800
申请号：	CN202310804190.1
公开号：	CN117031015A
代理机构：	北京卓恒知识产权代理事务所(特殊普通合伙)
代理人：	彭飞
分类号：	G01N33/569;G01N33/58;C07K14/165;C07K1/22;C12N15/50;C12N15/70;G;C;G01;C07;C12;G01N;C07K;C12N;G01N33;C07K14;C07K1;C12N15;G01N33/569;G01N33/58;C07K14/165;C07K1/22;C12N15/50;C12N15/70
申请人地址：	625000 四川省雅安市雨城区新康路46号
主权项：	1.一种用于检测猫冠状病毒抗体的间接ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有包被抗原M重组蛋白；M重组蛋白的氨基酸序列如SEQ.ID NO:1所示。 2.如权利要求1所述的用于检测猫冠状病毒抗体的间接ELISA试剂盒，其特征在于，所述M重组蛋白的制备方法，包括以下步骤： (a)将如SEQ.ID NO:1所示的基因连接到载体上，得到质粒，再用引物对基因进行PCR扩增； (b)将PCR扩增后的质粒进行电泳分离，回收纯化后连接至载体上，并转化至感受态细胞，得到第一重组质粒；采用双酶切电泳检测对第一重组质粒鉴定，再将电泳鉴定正确的第一重组质粒进行测序； (c)将上述测序正确的第一重组质粒和原核表达载体连接，得到第二重组质粒； (d)将第二重组质粒转化至大肠杆菌感受态细胞进行原核表达，得到重组蛋白，即M重组蛋白。 3.如权利要求2所述的用于检测猫冠状病毒抗体的间接ELISA试剂盒，其特征在于，所述M重组蛋白的制备方法还包括步骤(e)，采用His标签蛋白纯化试剂盒纯化重组蛋白后，再将重组蛋白与裂解液混合，破碎离心后，弃上清液，重悬，收集蛋白。 4.如权利要求2所述的用于检测猫冠状病毒抗体的间接ELISA试剂盒，其特征在于，步骤(a)中，采用如SEQ.ID NO:2所示的上游引物序列和如SEQ.ID NO:3所示的下游引物序列进行PCR扩增。 5.如权利要求2或4所述的用于检测猫冠状病毒抗体的间接ELISA试剂盒，其特征在于，所述步骤(a)中，所述PCR扩增：PCR扩增反应体系包括：DNA聚合酶、cDNA模板、上游引物、下游引物和水；PCR扩增反应条件为：92～95℃预变性2～5min后进入循环，92～95℃变性20～40s；50～65℃退火20～40s，70～75℃延伸10～25s，28～32个循环；70～75℃终延伸5～15min。 6.如权利要求2所述的用于检测猫冠状病毒抗体的间接ELISA试剂盒，其特征在于，所述步骤(b)中，所述双酶切电泳检测中的双酶切的位点分别为NdeⅠ和XhoⅠ；所述载体为pET30a；所述感受态细胞为大肠杆菌感受态细胞BL21。 7.如权利要求2所述的用于检测猫冠状病毒抗体的间接ELISA试剂盒，其特征在于，所述步骤(c)中，在原核表达中加入诱导剂进行诱导优化；诱导剂为IPTG；每添加1mL第二重组蛋白质粒菌液加入(0.1～1.25)mmol·L-1诱导剂。 8.如权利要求1所述的用于检测猫冠状病毒抗体的间接ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括ELISA板、阳性对照血清、阴性对照血清、洗涤液、血清样本稀释液、酶标抗体工作液、显色液和终止液；所述包被抗原的包被浓度为1.25～40μg/mL；酶标抗体工作液为HRP标记的兔抗猫IgG；血清样本稀释液中血清稀释度为1：(50～6400)。 9.权利要求1～8任一项所述的用于检测猫冠状病毒抗体的间接ELISA试剂盒的应用，其特征在于，所述试剂盒采用间接ELISA用于检测感染猫冠状病毒抗体。 10.如权利要求1所述的用于检测猫冠状病毒抗体的间接ELISA试剂盒的应用，其特征在于，所述试剂盒检测猫冠状病毒抗体的步骤及阳性判定标准如下：将M重组蛋白溶于包被液中，加入ELISA板中进行包被，洗涤；将阳性对照血清及阴性对照血清稀释后，分别加入ELISA板；剩下的孔加入血清样本稀释液进行反应；洗涤后，加入工作浓度的酶标抗体工作液，反应；洗涤后，加入显色液显色，之后加入终止液终止显示，读取OD450nm吸光值，OD450nm大于0.315的孔判为阳性。
所属类别：	发明专利