专利名称: |
固定化pH梯度毛细管等电聚焦测定微生物等电点的方法 |
摘要: |
本发明涉及一种毛细管电泳用于微生物等电点的测定方法,属于生物
分析领域。本发明首先将载体两性电解质溶液在毛细管内采用恒定电压进
行等电聚焦,使毛细管内壁上形成连续pH梯度的两性电解质;其次将样品
溶液注入毛细管中,采用恒定电压等电聚焦;然后采用固定气压,将毛细
管内样品从聚焦段匀速推动经过检查窗口,可确定样品聚焦点的位置;最
后根据pH梯度与毛细管长的线性关系,求出聚焦点的pH值。本方法可用
于多种微生物同时在线检测,对于微生物等电点检测具有普适性。 |
专利类型: |
发明专利 |
国家地区组织代码: |
北京;11 |
申请人: |
北京理工大学 |
发明人: |
屈 锋;蔡波太;马文韬 |
专利状态: |
有效 |
申请日期: |
2009-05-25T00:00:00+0800 |
发布日期: |
2019-01-01T00:00:00+0800 |
申请号: |
CN200910084833.X |
公开号: |
CN101556260 |
代理机构: |
北京理工大学专利中心 |
代理人: |
张利萍 |
分类号: |
G01N27/447(2006.01)I |
申请人地址: |
100081北京市海淀区中关村南大街5号 |
主权项: |
1、固定化pH梯度的毛细管等电聚焦测定微生物等电点的方法,其特
征在于具体测量步骤如下:
1)首先对毛细管进行预处理,依次用0.1M HCl冲洗10min以上、水
冲洗5min以上、1MNaOH冲洗20min以上、0.1MNaOH冲洗20min以
上、水冲洗20min以上及甲醇冲洗20min以上,氮气吹干后备用;将异氰
酸酯加入无水吡啶溶液后注入毛细管中,在65~75℃反应12小时以上,使
异氰酸酯键合于毛细管内壁;再依次用甲苯,甲醇,三蒸水,20mM pH7.0
的磷酸盐缓冲液冲洗毛细管内壁,各冲洗10min以上;
2)将载体两性电解质溶液(Ampholine)以1%~5%体积比溶于20mM
磷酸盐缓冲液中,将混合溶液注入毛细管;将靠近检测窗口的一端插入阴
极缓冲液,另一端插入阳极缓冲液,然后加10~25KV的恒定电压进行等电
聚焦,待电流稳定后聚焦完成,将毛细管两端插入去离子水中,静置反应
12小时以上,使毛细管内壁上形成连续pH梯度的两性电解质;
其中阴极缓冲液15~20mM的NaOH溶液,阳极缓冲液为15~20mM的
H3PO4溶液;
3)将上步制得的毛细管用pH 7.0的磷酸盐缓冲液冲洗1h以上;将样
品微生物加入pH7.0的磷酸盐缓冲液中制备成浓度为104~105cfu/ml样品溶
液,将样品溶液注入毛细管中,采用10~25KV的恒定电压等电聚焦;待电
流平稳后,聚焦完成,停止加电压;用固定气压,将毛细管内样品从聚焦
段匀速推动经过检查窗口,记录对样品开始加压到经过检测窗口的时间;
4)再次注入样品,求出采用步骤3)中的固定气压使样品从毛细管注
入端流经检测窗口的时间,由于毛细管长度已知,从而得到该固定气压下
样品溶液在毛细管内的匀速迁移速度,再很据步骤3)得到的样品开始加压
到经过检测窗口的时间,求出该固定气压下样品从聚焦点到经过检测窗口
的距离,即可求得聚焦点到进口端的距离L差;
5)根据pH梯度与毛细管长的线性关系,求出聚焦点的pH值的表示
公式:
pH求=pH始+pH差(L差/L总)
其中“pH始”表示选用载体两性电解质溶液的pH最小值,“pH差”
表示选用载体两性电解质溶液的pH范围差;“L差”表示聚焦点到进口端
的距离;“L总”表示毛细管的总长度;
6)将步骤4)求得的“L差”代入线性方程即可求出样品在聚焦点出的
pH值。 |
所属类别: |
发明专利 |