主权项: |
1.一种抑癌基因遗传风险评估的基因检测方法,其特征在于,其方法为:
步骤1.检测的样品类型与采样方法:
用采样拭在20-30个被测者口腔中分别左右两腮至少需要各上下刮40
次以上,以保证采集到足量的细胞样本;
步骤2.基因组DNA的抽提方法:
采用硅胶吸附法抽提每一个口腔上皮细胞样本的基因组DNA,时间为2小
时-2.5小时,共抽提20-30个被测者样本,经电泳检测后,用肉眼可
见清晰白色条带即可判断获得的DNA能进入下一步检测;
步骤3:荧光定量PCR反应
将每一个被测者样本分别放入3个反应孔,同时检测抑癌基因TP53(P53BP1)
SEQ ID NO1:T-885G、抑癌基因TP53(P53BP1)SEQ ID NO2:Gln1136Lys、抑
癌基因TP53(TP53)SEQ ID NO3:Arg72Pro 3个位点,20-30个被测者样本就
有60-90个反应孔,并增设不含DNA模版的NTC空白对照孔;
每一个反应孔的基因分型根据下表的引物和探针设计,采用 id="icf0001" file="A2008100420270002C1.tif" wi="15" he="4" top= "136" left = "147" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/>-MGB
技术,进行检测试剂合成;
在每一个反应孔中加入试剂为荧光定量PCR反应体系,总体积为10μl,即
浓度为20ng/μl的DNA模板2μl、1μl 10X荧光定量PCR反应缓冲液ABI id="icf0002" file="A2008100420270002C2.tif" wi="12" he="3" top= "162" left = "158" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/>
id="icf0003" file="A2008100420270002C3.tif" wi="2" he="2" top= "170" left = "22" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/>MGB、0.1μl 25mM d NTP合成DNA的四种脱氧核苷酸底物、0.5μl 25mM MgCl2
溶液、0.02μl(5units/μl)Taq DNA聚合酶、去离子水5.43μl、3个位点分别
采用不同的正向引物(20μM,0.225μl)、反向引物(20μM,0.225μl)、VIC荧光
探针(10μM,0.25μl)和FAM荧光探针(10μM,0.25μl)工具进行检测,
将61-91个反应孔在ABI9700型PCR扩增仪上进行反应,先进行预热50℃、
2分钟,95℃、10分钟,然后再进行60个循环的95℃、30秒,60℃、1分钟、
反应结束后取出后再放入ABI7900型荧光定量PCR仪上读取样品荧光量,并自动
将20-30个被测者样本检测3个点位的数据对号入座到3个图中,同时生成3
张图,是抑癌基因TP53(P53BP1)SEQ ID NO1:T-885G图、抑癌基因TP53(P53BP1)
SEQ ID NO2:Gln1136Lys图、抑癌基因TP53(TP53)SEQ ID NO3:Arg72Pro图;
步骤4:SNP基因型分析
将ABI7900型荧光定量PCR仪上显示的最终样本荧光信号的3个表和一个
NTC空白对照进行比较,每个位点理论上存在三种不同的信号,纯VIC荧光信号、
VIC和FAM杂合荧光信号以及纯FAM荧光信号,分别代表该位点三种不同的基因
型;
(1)、抑癌基因TP53(P53BP1)SEQ ID NO1:T-885G
在检测结果图中,共有21-31个点,每个点代表一个被测者样本的检测结果,
坐标轴(X:0.4-0.5Y:0.3-0.4)区域为空白对照、坐标轴(X:0.2-0.4Y:
1.1-1.3)区域为TT基因型、坐标轴(X:0.6-0.8Y:0.7-1.0)区域为TG基因
型、坐标轴(X:0.7-0.9Y:0.3-0.4)区域为GG基因型,其中,TT、TG为风
险基因型,携带风险基因型时,蛋白质翻译减少或编码突变型蛋白质时均可导致
细胞的恶变,导致癌症易感性增加;
(2)、抑癌基因TP53(P53BP1)SEQ ID NO2:Gln1136Lys
在检测结果图中,共有21-31个点,每个点代表一个被测者样本的检测结果,
坐标轴(X:0.0-0.1Y:0.1-0.3)区域为空白对照、坐标轴(X:0.0-0.1Y:
1.1-1.3)区域为AA基因型、坐标轴(X:0.2-0.3Y:0.9-1.2)区域为AG基因
型、坐标轴(X:0.35-0.45Y:0.4-0.6)区域为CC基因型,其中,AA为风险
基因型,携带风险基因型时,蛋白质翻译减少或编码突变型蛋白质时均可导致细
胞的恶变,导致癌症易感性增加;
(3)、抑癌基因TP53(TP53)SEQ ID NO3:Arg72Pro
在检测结果图中,共有21-31个点,每个点代表一个被测者样本的检测结果,
坐标轴(X:0.0-0.1Y:0.3-0.4)区域为空白对照、坐标轴(X:0.1-0.3Y:
1.6-1.9)区域为CC基因型、坐标轴(X:0.6-0.8Y:1.1-1.4)区域为CG基因
型、坐标轴(X:0.9-1.1Y:0.4-0.6)区域为GG基因型,其中,CC为风险基
因型,携带风险基因型时,蛋白质翻译减少或编码突变型蛋白质时均可导致细胞
的恶变,导致癌症易感性增加;
每一个被测者的3个点落在3个表上哪个区域,即可知道被测者抑癌基因的
遗传风险。 |