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白细胞介素6基因重组逆转录病毒载体的构建方法
| 专利名称： | 白细胞介素6基因重组逆转录病毒载体的构建方法 |
| 摘要： | 本发明公开一种白细胞介素6基因重组逆转录病毒载体的构建方法，其步骤如下：（1）白细胞介素6（IL-6）基因片段的扩增；（2）重组pSEB-rIL6逆转录病毒质粒的构建和鉴定；（3）重组pSEB-rIL6逆转录病毒质粒在真核细胞中表达功能的测定。本发明所构建的逆转录病毒pSEB-IL6质粒可作为真核表达载体，能够感染多种类型的细胞，既可以应用于体外培养的细胞，也可以用于整体实验动物，应用范围广，感染效率高；所采用的载体-逆转录病毒是改造后的一种安全的病毒，该载体不仅带有组蛋白标签，实时检测表达水平；而且可以整合入宿主细胞中，随着细胞的不断分裂而持续表达；构建过程中所需设备要求不高，逆转录病毒载体的理化性质稳定，在制备、储存和应用过程中简单易行，适合推广应用。 |
| 专利类型： | 发明专利 |
| 国家地区组织代码： | 重庆;85 |
| 申请人： | 重庆医科大学附属儿童医院 |
| 发明人： | 陈洁;张贇;毕杨;龚敏;李廷玉;魏小平;孙五庆 |
| 专利状态： | 有效 |
| 申请日期： | 2010-09-24T00:00:00+0800 |
| 发布日期： | 2019-01-01T00:00:00+0800 |
| 申请号： | CN201010289423.1 |
| 公开号： | CN101948863A |
| 代理机构： | 重庆华科专利事务所 50123 |
| 代理人： | 徐先禄 |
| 分类号： | C12N15/66(2006.01)I |
| 申请人地址： | 400014 重庆市渝中区中山二路136号 |
| 主权项： | 白细胞介素6基因重组逆转录病毒载体的构建方法，其步骤如下：（1）白细胞介素6（IL 6）基因片段的扩增；通过逆转录 聚合酶链反应（RT PCR）方法，以大鼠骨髓间充质干细胞cDNA为模板，分别在上游引物的5’端和下游引物3’端设计HinDⅢ和BamHⅠ限制性内切酶酶切位点（斜体下划线为酶切位点），即 上游引物5’ ATCAAGCTT ACCACCATGGGC ATGAAGTTTCTCTCCGC 3’上游引物5’ CGT GGATCC GGTTTGCCGAGTAGACCTCATAGTGAC 3’touch down PCR扩增获得IL 6目的基因片段rIL6；（2）重组pSEB rIL6逆转录病毒质粒的构建和鉴定；采用pSEB逆转录病毒载体系统, 该系统具有组蛋白标签、hEFH启动子及开放读码框（ORP）；hEFH启动子可有效启动插入ORP中靶基因的高效表达，同时3组6个连续组蛋白可以作为检测标签，反映ORP中插入靶基因的表达水平；将步骤（1）中所获得的基因片段rIL6的PCR产物及逆转录病毒载体pSEB 3H分别经HinDⅢ和BamHⅠ双酶切，连接转化进入DH2a感受态菌中，通过氨苄青霉素筛选单克隆，获得具有IL 6重组的逆转录病毒质粒pSEB IL6，并进行PCR、双酶切及序列鉴定；（3）重组pSEB rIL6逆转录病毒质粒在真核细胞中表达功能的测定；针对步骤（2）所获得正确序列的逆转录病毒pSEB IL6质粒在真核细胞中的表达应用,利用脂质体转染系统，将步骤（2）中所获得的逆转录病毒pSEB IL6质粒分别转染到大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞和人胚肾细胞HEK293中，mRNA水平和蛋白水平测定IL 6的表达水平。 |
| 所属类别： | 发明专利 |
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