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原文传递基于二代测序对船舶压载水和沉积物微生物多样性的研究

论文题名：	基于二代测序对船舶压载水和沉积物微生物多样性的研究
关键词：	船舶压载水;沉积物;D-2标准;2b-RAD;宏基因组
摘要：	当前，国际货物运输的90％依靠船舶运输，而船舶压载水和沉积物的排放是外来物种入侵的重要载体之一。据统计全球每天压载水转运多达7000到10000种生物，这些外来生物一旦爆发，会给全球海洋生态带来巨大的危害。压载水中携带的微生物由于难以识别、种类繁多且不易培养，一直是压载水管理的难点。国际海事组织(InternationalMaritimeOrganization，IMO)于2004年发布的《压载水公约》对于微生物监测(D-2标准)仅选取了可培养的大肠杆菌(Escherichiacoli)、有毒霍乱弧菌(Vibriocholerae(O1and039))和肠道球菌(IntestinalEnterococci)作为监测指标，即这三类指示性细菌浓度在D-2标准以下则认为是可以排放的合格水质。除这三类指示菌外，压载水中微生物种类和组成有何特点？有害微生物种类和数量如何？这些有关压载水微生物防控和管理的重要问题尚不清晰。高通量测序技术的发展使无需培养即可检测微生物多样性成为可能。本文以2b-RAD简化基因组测序和宏基因组测序研究压载水和沉积物中微生物多样性，探索压载水微生物监测方法，揭示压载水微生物多样性，特别是致病微生物的种类，以期为我国压载水监测和管理提供技术参考。　　本文利用2b-RAD简化基因组测序技术捕获DNA片段短、物种分辨率高的优点，研究了船舶压载水及沉积物中的细菌多样性。在六个船舶压载水和沉积物样本中共检测到1946种微生物，包含13种对海洋环境具有重大潜在危害性的病原体。研究表明变形菌门(Proteobacteria)是压载水样本的优势类群(相对丰度71.67％-92.21％)，拟杆菌门(Bacteroidetes)（平均相对丰度32.73％）和变形菌门(Proteobacteria)（平均相对丰度30.37％）是沉积物样本中的优势类群。此外，沉积物样本不仅相较于压载水样本具有更高的物种丰富度（平均1.4倍），而且包含了压载水样本的部分病原体(30.77％)，这显示出目前压载水管理重视压载水而忽视沉积物监测，可能存在风险。　　本文利用宏基因组测序技术具有的高度灵敏性特点，对四个船舶压载水和沉积物样本微生物多样性进行了研究，揭示了压载水和沉积物中隐藏的巨大的微生物多样性。本研究检测到物种14403种，其中细菌11710种、古菌829种、真菌380种、病毒790种，是目前压载水监测中报道物种最多的研究。类群分析结果显示变形菌门(Proteobacteria)在所有样本中占优势地位（平均相对丰度72.78％），拟杆菌门(Bacteroidetes)丰度在压载水样本中明显高于沉积物样本(15.25％vs.3.40％)，放线菌门(Actinomycetes)在沉积物样本中丰度明显高于压载水样本(11.51％vs.2.06％)，这显示出在压载水环境中微生物群落组成可能与其生境相适应。　　通过数据库比对和文献检索，本文共发现422种致病微生物，是目前在压载水中发现致病微生物最多的研究。其中炭疽芽孢杆菌（Bacillusanthracis）、结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis）、鼠疫耶尔森菌（Yersiniapestis）等68种（类）致病微生物被列入《人间传染的病原微生物名录》和《动物病原微生物分类名录》;鱼类、虾类等海洋养殖领域病原体如杀鲑气单胞菌（Aeromonassalmonicida）、溶藻弧菌（Vibrioalginolyticus）等对海洋养殖业具有重大潜在危害的物种27种。此外，本文还发现了鲍鱼萎缩症相关病毒(Abaloneshrivelingsyndrome-associatedvirus)、红细胞坏死病毒（Erythrocyticnecrosisvirus）等5种具有潜在致病性的病毒，均存在于沉积物样本中。通过将非冗余基因集注释到KEGG数据库，研究了微生物组成和功能与压载水生境的适应关系，结果表明压载水和沉积物微生物群落中新陈代谢为主要功能，具体以碳水化合物代谢、碳代谢、氨基酸的生物合成、氨基酸代谢、能量代谢等功能通路为主。　　综上所述，本文综合运用2b-RAD简化基因组测序和宏基因组测序技术，利用其类群高分辨率的优势，将微生物研究中通常使用的操作分类单元（OperationalTaxonomicUnit，OTU）转化为具有生物学意义的物种，真实地展示了船舶压载水和沉积物中微生物多样性，发现了多种潜在病原体，揭示出压载水管理中沉积物的重要性。同时，基于高通量的宏基因组测序技术探索出压载水微生物监测和分析的新方法，研究结果为我国压载水管理和监测提供技术参考和应用基础。
作者：	薛朝朝
专业：	生物工程
导师：	赵宏;张伟
授予学位：	硕士
授予学位单位：	山东大学
学位年度：	2022