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原文传递实时荧光定量PCR检测CA6病毒的方法

专利名称：	实时荧光定量PCR检测CA6病毒的方法
摘要：	本发明属核酸检测领域，涉及一种实时荧光定量PCR检测CA6病毒的方法；该方法基于CA6VP1序列设计了特异性的引物和Taqman探针，用于快速、特异和高灵敏度地检测CA6病毒，本发明方法能稳定和有效地扩增CA6基因片段，最高检测灵敏度能达到10copies/μl；且该方法的特异性高，未观察到假阳性的结果；本发明方法检测CA6快速，灵敏，可靠。可进一步用于大规模标本的实验室检测，及用于CA6的流行病学的监测工作，有助于临床实践中的早期快速诊断。
专利类型：	发明专利
申请人：	上海市公共卫生临床中心
发明人：	胡芸文;管文彩;张晓玲;宋志刚
专利状态：	有效
申请日期：	2013-04-14T00:00:00+0800
发布日期：	2019-01-01T00:00:00+0800
申请号：	CN201310127090.6
公开号：	CN104099427A
代理机构：	上海元一成知识产权代理事务所(普通合伙) 31268
代理人：	吴桂琴
分类号：	C12Q1/70(2006.01)I
申请人地址：	201508 上海市金山区漕廊公路2901号
主权项：	一种实时荧光定量PCR检测CA6病毒的方法，其特征在于，其包括步骤：（1）采集标本收集手足口病患者的咽拭子、粪便标本；（2）设计引物根据Genbank库中收录的CA6的衣壳蛋白VP1编码序列并结合CA6流行地区的VP1序列，设计合成CA6特异性real?time?PCR的引物和探针，然后分析上述述引物和探针的保守性；（3）提取核酸，Real?time?PCR和T?A克隆提取病毒基因组RNA；将样本加入含poly(A)的Binding?Buffer中，再加入蛋白酶K混匀，72?℃裂解，用柱子吸附RNA，加入Inhibitor?Removal?Buffer洗1次；再用Wash?Buffer洗2次，最后用Elution?Buffer洗脱RNA；PCR采用试剂盒（Takara?DRR064A）进行，25μl反应液中包含2×?Buffer?Mix12.5μl,?TaKaRa?Ex?Taq?HS（5?U/?μl）0.5μl,?PrimeScript?RT?Enzyme?MixⅡ0.5μl,?上游引物CA6F?10pmol,下游引物CA6R?10pmol，探针3pmol,RNA模板2.5μl；其中，PCR反应条件：42℃反转录，10min；95℃10s，60℃40s，运行45个循环，在60℃进行荧光采集；反应在实时荧光定量PCR仪上进行，引物和探针序列为，*参考的CA6病毒株为TW/399/10（Genbank?No.?JQ946054）；取Real?time?RT?PCR阳性产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳；采用割胶纯化试剂盒回收107bp?大小的PCR产物，通过T?A克隆试剂盒将PCR产物克隆进pMD18?T载体；通过测序获得克隆片段序列，然后用BLAST工具对克隆片段进行比对分析；（4）评估Real?time?RT?PCR的灵敏度和特异性采用T?A克隆质粒制作标准品进行Standard?curve实验的方法：首先微量紫外分光光度计对克隆质粒进行核酸定量，然后进行10倍模板稀释，制作10⁷～10²copies/μl的标准品；以所述标准品为模板进行Real?time?RT?PCR，获得Standard?curve；选取18种HEV血清型，包括EV71，EV68，CVA2，CVA4，CVA5，CVA10，CVA12，CVA21，CVB1，CVB2，CVB4，CVB5，Echo?3,?Echo?9,?Echo?19,?Echo?25,?Echo?30验证该PCR方法的特异性：首先采用High?Pure?Viral?Nucleic?Acid?Kit提取上述病毒株的基因组RNA，再以上述基因组RNA为模板并选择克隆质粒为阳性对照品进行real?time?RT?PCR，观察扩增曲线；（5）Real?time?RT?PCR检测临床标本?对采集的标本，进行核酸提取；然后采用RT?PCR进行肠道病毒属特异性筛选；筛选出的肠道病毒阳性标本再采用RT?PCR的方法进行EV71和CA16的筛选；肠道病毒属检测阳性而EV71和CA16检测阴性的标本，采用Real?time?RT?PCR方法检测CA6，同时，采用RT?snPCR方法对上述标本进行平行检测分型，验证新荧光定量PCR方法的准确性。
所属类别：	发明专利