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原文传递一种基于细胞代谢组学的甜茶素抗脂毒性的差异代谢物代谢通路及研究方法

专利名称：	一种基于细胞代谢组学的甜茶素抗脂毒性的差异代谢物代谢通路及研究方法
摘要：	本发明公开了一种基于细胞代谢组学的甜茶素抗脂毒性的差异代谢物代谢通路及研究方法，涉及一种天然植物药有效成分作用机制的研究方法。本发明要解决现有的单一的药理学方法不能系统、全面地评价天然植物药有效成分作用机制的问题。通过以下步骤实现：(1)采用超高液相色谱‑串联质谱技术检测分析棕榈酸诱导大鼠胰岛素瘤细胞及甜茶素干预后的细胞内代谢产物；(2)筛选出12个潜在脂毒性相关差异代谢物并进行鉴定；(3)筛选出甜茶素抗脂毒性的4个代谢通路和通路上相关酶和基因并进行分析。本发明可更全面、高效、快速的从细胞水平无偏向性的综合评价甜茶素抗脂毒性作用机制，为天然植物药有效成分的细胞代谢组学及作用机制的阐明提供示范性依据。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	广西;45
申请人：	广西医科大学
发明人：	郑华;苏志恒;吴金霞;孟春梅;黄远洁;李卫东;何丽丽
专利状态：	有效
发布日期：	2019-01-01T00:00:00+0800
申请号：	CN201810150407.0
公开号：	CN108414635A
代理机构：	广西南宁公平知识产权代理有限公司 45104
代理人：	王素娥
分类号：	G01N30/02(2006.01)I;G;G01;G01N;G01N30;G01N30/02
申请人地址：	530021 广西壮族自治区南宁市青秀区双拥路22号广西医科大学生命科学研究院
主权项：	1.一种基于细胞代谢组学的甜茶素抗脂毒性的差异代谢物代谢通路及研究方法，其特征在于：采用基于超高液相色谱‑串联质谱技术检测分析棕榈酸诱导大鼠胰岛素瘤细胞及甜茶素干预后的细胞内代谢产物，获得代谢指纹图谱。利用多元变量统计分析筛选出十二个潜在脂毒性相关的生物标志物并进行鉴定，通过metaboanalyst在线分析软件筛选出甜茶素抗脂毒性的四个代谢通路和代谢通路上相关酶和基因；所述获得代谢指纹图谱的具体实现步骤如下：(1)所需细胞样品的采集：取生长状态良好的大鼠胰岛素瘤细胞接种于96孔培养板，按随机原则分为对照组、棕榈酸模型组和甜茶素干预组，每组三个样品，把收集到细胞的离心管放到液氮和37℃水浴箱中反复冻融五个周期，每个周期为液氮5min，37℃水浴5min，进行淬灭；(2)细胞样品的预处理和保存：在离心管中加入1mL乙腈，在温度4℃条件下离心10min，离心转速为13000g·min‑1，进行细胞代谢物的提取；(3)样品质谱分析：对收集的各组大鼠胰岛素瘤细胞样品进行方法学考察，建立超高液相色谱‑串联质谱技术检测分析大鼠胰岛素瘤细胞样品指纹图谱分析方法，对细胞样品依次进行超高液相色谱‑质谱分析；超高液相色谱分析条件：采用Waters公司超高压液相色谱系统进行检测，HSS T3色谱柱,色谱柱规格为100mm×2.1mm，固定相粒径1.8μm，柱温37℃，流动相A乙腈，B 0.1％甲酸水，梯度洗脱：0～3min，3％A；3～8min，3～13％A；8～12min，13～20％A；12～17min，20～35％A；17～22min，35～60％A；22～30min，60～95％A；30～32min，95％A；32～34min，95～3％A；34～36min，3％A。流速为0.4mL·min‑1，进样量3μL；质谱条件：应用Waters MS公司高精度的三重四级杆质谱进行检测，其条件为电喷雾离子ESI源，正离子模式下扫描：毛细管电压3.0kV，离子源温度120℃，脱溶剂气温度350℃，锥孔电压40V，离子能量1.0V锥孔气流量50L·h‑1，脱溶剂流量600L·h‑1，在碰撞能量为4eV情况下扫描时间为0.5s，间隔扫描时间0.02s；准确质量测定采用亮氨酸‑脑啡肽溶液为锁定质量溶液；扫描范围m/z 50～1000，以Centriod模式进行数据采集，对九个样品重复进样六针，考察重现性，确保获得可靠数据；(4)数据预处理：采用Waters公司的Masslynx软件进行去噪音、质谱峰提取、峰排列、峰对齐及归一化等处理，得到各个峰的峰高或者峰面积及保留时间等数据；(5)利用多元变量统计分析并筛选潜在生物标志物：在获得超高液相色谱‑串联质谱数据后，采用SIMCA‑P12.0软件对导入的数据对对照组、棕榈酸模型组、甜茶素干预组三组样本进行主成分分析和偏最小方差判别分析；主成分分析作为无监督式学习方法，可以真实反映样本的聚类情况，棕榈酸诱导组与空白对照组分离良好，无交叉和重叠，说明两组代谢模式存在明显的差异；甜茶素组介于与空白组和棕榈酸诱导模型组之间，更靠近空白组，提示甜茶素干预后大鼠胰岛素瘤细胞代谢模式出现改变，表明甜茶素对棕榈酸诱导的大鼠胰岛素瘤细胞的代谢紊乱有一定的干预作用；进一步采用有监督式方法进行建模分析，所建模型变量的拟合能力指数R2Y为0.974,模型的预测指数Q2cum为0.955，模型的参数R2Y表示模型的解释率，Q2cum表示模型的预测率；空白对照组和棕榈酸诱导模型组大鼠胰岛素瘤细胞的偏最小方差分析PLS‑DA载荷图中的每一个点代表一个变量，变量对分类的重要程度由变量重要性投影的大小来衡量，并依据其对变量进行筛选；采用SPSS16.0软件进行统计学处理，选择变量重要性投影值>1且具有统计学意义的变量作为潜在生物标志物；基于超高液相色谱‑串联质谱技术的大鼠胰岛细胞瘤细胞PLS‑DA得分图表示主成分分析PCA得分图，图中每一个点代表一个样品，棕榈酸诱导组与空白对照组分离良好，无交叉和重叠，说明两组代谢模式存在明显的差异；甜茶素组介于与空白组和棕榈酸诱导模型组之间，更靠近空白组，提示甜茶素干预后大鼠胰岛素瘤细胞代谢模式出现改变，表明甜茶素对棕榈酸诱导的大鼠胰岛素瘤细胞的代谢紊乱有一定的干预作用；按基于超高液相色谱‑串联质谱技术的大鼠胰岛细胞瘤细胞PLS‑DA得分图的结果，使用SPSS统计软件进行偏最小方差分析PLS‑DA得到空白对照组和棕榈酸诱导模型组大鼠胰岛细胞瘤细胞的偏最小方差分析PLS‑DA载荷图，能够突显出空白组和棕榈酸诱导组差异的最大化合物，可被认为是与脂毒性相关的潜在标志物；(6)潜在生物标志物的鉴定：根据变量对应的保留时间和分子量，检索公共数据库KEGG、HMDB和METLIN对潜在生物标志物进行鉴定，并与文献进行比较，最终鉴定了十二个与脂毒性相关的差异代谢产物：溶血卵磷脂、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、心磷脂、神经酰胺、神经节苷脂GA2、神经节苷脂GM2、鞘氨醇、磷脂酸、前列腺素、磷脂酰甘油、磷脂酰甘油磷脂，其中溶血卵磷脂、神经节苷脂GA2、神经节苷脂GM2和磷脂酰乙醇胺上调，磷脂酰丝氨酸、心磷脂、神经酰胺、鞘氨醇、磷脂酸、前列腺素、磷脂酰甘油、磷脂酰甘油磷脂下调；(7)差异代谢物的分析：将筛选鉴定出的差异代谢产物上传到metaboanalyst在线分析软件，采用细胞代谢物数据库进行代谢物匹配，对甜茶素干预后的大鼠胰岛细胞瘤细胞受影响显著的代谢通路进行富集分析和拓扑分析，构建分析代谢通路图；在构建的代谢通路图中，四条代谢通路上的基因和酶形成相互交错的网络，通过代谢通路分析后所得影响值，当影响值大于0.5时，该条代谢通路在代谢网络中具有重要影响，在使用metaboanalyst平台进行分析的代谢通路总结图中，依据代谢通路的p值和通路重要值确定甘油磷脂代谢通路、鞘脂代谢通路和花生四烯酸代谢通路和磷脂酶D通路均与脂毒性相关，甜茶素干预大鼠胰岛细胞瘤细胞后起效最为相关的是甘油磷脂代谢通路；在四个代谢通路中所涉及的酶和基因网络联系图中，有二十三个酶和二十八个基因参与了脂毒性的形成。
所属类别：	发明专利