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一种蛋白质芯片筛选生物标志方法
| 专利名称： | 一种蛋白质芯片筛选生物标志方法 |
| 摘要： | 本发明涉及一种蛋白质芯片筛选生物标志方法，其特征在于，包括如下步骤：制备蛋白质芯片、细胞样本预处理、目标蛋白提取、生物标志筛选，本发明改进了基质材料的表面处理技术，可减少蛋白质的非特异性结合；提供了合适的温度和湿度，能够保持芯片表面蛋白质的稳定性及生物活性。 |
| 专利类型： | 发明专利 |
| 国家地区组织代码： | 上海;31 |
| 申请人： | 爱必信（上海）生物科技有限公司 |
| 发明人： | 郭惠芳 |
| 专利状态： | 有效 |
| 发布日期： | 2019-01-01T00:00:00+0800 |
| 申请号： | CN201810603240.9 |
| 公开号： | CN109001460A |
| 分类号： | G01N33/68(2006.01)I;G;G01;G01N;G01N33;G01N33/68 |
| 申请人地址： | 201314 上海市浦东新区古丹路15弄18号楼2楼 |
| 主权项： | 1.本发明涉及一种蛋白质芯片筛选生物标志方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、制备蛋白质芯片所述蛋白质芯片包括载玻片、中间层和探测层，制备所述蛋白质芯片的具体步骤如下：a.选择一块所述载玻片，所述载玻片为正方形，厚度为2‑5mm，尺寸为6mm×6mm，将其置入30％的过氧化氢中浸泡20‑30分钟，再用去离子水冲洗干净，在50‑60℃条件下烘干待用；b.将步骤a处理好的所述载玻片浸入到100ml25％为巯基乙酸溶液中，20‑30℃条件下浸泡30分钟，可得到所述中间层；c.将步骤b处理好的所述载玻片全部浸入到100ml的45％的生物探针中浸泡1‑1.5小时，可得到所述探测层；所述生物探针为能与目标蛋白结合的抗体；d.取出步骤c处理好的所述载玻片用去离子水冲洗干净，可得所述蛋白质芯片；将所述生物探针的蛋白质芯片置于50‑75℃烘箱中干燥待用；S2、细胞样本预处理a.用研钵在‑10℃冷冻条件下将细胞样本研成粉末，用4℃的PBS溶液清洗所述细胞样本2‑3次；b.对每100000个步骤a处理后的所述细胞样本，加入0.5ml裂解液，裂解20‑30分钟，将所述细胞样本裂解液收集到EP管中，加入10ml细胞样本蛋白提取缓冲液，使用细胞匀浆器匀浆30s；以重量百分比计，所述裂解液包括0.05‑0.1％的氯化铵、0.05‑0.1％的氯化钠、0.1‑1.5％的EDTA、0.005‑0.01％的过氧化氢、0.02‑0.1％TritoAx‑100和0.05‑0.2％目标蛋白分解酶；余下部分为去离子水；以重量百分比计，所述细胞样本蛋白提取缓冲液包括0.01‑0.15％的Tris、0.01‑0.1％的氯化钠、0.05‑0.5％的AP40、0.05‑0.2％的Aproti，余下部分为去离子水；c.将步骤b处理好细胞悬液置于4℃下，以3000rpB转速离心5分钟；放置3‑4分钟，直至所述细胞悬液变清，避开上层漂浮的脂质层，取上清液，得到细胞样本预处理液；S3、目标蛋白提取a.取50ml所述细胞样本预处理液置于EP管中，并放入一块蛋白质芯片，置于4℃条件下3‑5小时，让目标组蛋白与所述蛋白质芯片上的所述生物探针结合；b.对应每100000个所述细胞样本，在装有所述细胞样本裂解液EP管中，加入20μl100mM氯化钠溶液，轻轻重悬所述蛋白质芯片上的所述生物探针；c.40‑50℃水浴加热10分钟后，将所述EP管放在磁力架上，去除上清，用200ul4℃的0.5mMEDTA溶液洗涤1‑2次，用200ul350mM氯化钠溶液洗涤2‑3次，用200ul50mMTris‑HCl溶液洗涤2‑3次，以上洗涤每次10‑15分钟；d.加50ul洗脱缓冲液在37℃洗脱30分钟，转上清至新的离心管中加2.5ug目标蛋白分解酶，在50‑75℃条件下解交联过夜；再用150ul所述洗脱缓冲液在37℃洗脱所述蛋白质芯片上的所述生物探针20‑30分钟，溶出所述目标蛋白；以重量百分比计，所述洗脱缓冲液包括5‑15％的氯化镁、10‑20％的氯化钠、20‑25％的乙二醇、0.001‑0.01％的硫氰酸钠和0.5‑0.2％SDS；余下部分为去离子水；S4、生物标志筛选通过质谱分析和等离子共振对所述蛋白质芯片进行检测，提取所述目标蛋白质的功能注释条目，分析所述目标蛋白集中度；常采用基于超几何分布的假设检验方法，其计算方法如公式一所示：公式一： |
| 所属类别： | 发明专利 |
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