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原文传递一种纸基双模式检测镁离子的方法

专利名称：	一种纸基双模式检测镁离子的方法
摘要：	本发明公开了一种纸基双模式检测镁离子的方法。利用蜡打印和激光切割技术在纸上制备疏水区域和亲水区域，并借助丝网印刷技术，印制三电极。通过对纸芯片的不同区域进行功能化，利用材料粒径和纸纤维孔径间的大小差异，3，3’‑二氨基联苯胺的显色作用以及镁离子与其特异性DNA酶的识别作用，可以实现对镁离子的可视化定性和电化学发光精准检测。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	山东;37
申请人：	济南大学
发明人：	徐金梦;张彦;黄煜真;李丽;杨红梅;崔康;于京华
专利状态：	有效
发布日期：	2019-01-01T00:00:00+0800
申请号：	CN201810453724.X
公开号：	CN108760730A
代理机构：	济南誉丰专利代理事务所(普通合伙企业) 37240
代理人：	高强
分类号：	G01N21/78(2006.01)I;G01N27/26(2006.01)I;G;G01;G01N;G01N21;G01N27;G01N21/78;G01N27/26
申请人地址：	250022 山东省济南市市中区南辛庄西路336号
主权项：	1.一种纸基双模式检测镁离子的方法，其特征是包括以下步骤：(1) 在计算机上利用Adobe Illustrator CS4软件设计疏水蜡打印图案并利用固态蜡打印机将其批量打印到裁剪的A4尺寸滤纸上，随后将其在加热板加热至蜡融化并渗透整个纸的厚度，形成疏水墙，借助折纸技术构筑纸器件；该纸器件包含两部分，分别为电化学发光检测区和比色区，其中电化学发光检测区印有圆形亲水区域和矩形亲水区域，分别用来印刷三电极和辅助连通三电极，比色区印有圆形亲水工作区域和矩形亲水比色条，分别用来辅助液体渗透到电化学发光检测区圆形亲水区域和记录颜色长度；(2) 采用丝网印刷的方法，将碳对电极，碳工作电极和Ag/AgCl参比电极自左到右依次印刷到纸器件背面电化学发光检测区圆形亲水区域，且印刷的电极面积小于预留亲水区域面积，纸器件可沿虚线部分进行切割，沿实线部分进行折叠，可使比色区圆形亲水区域与电化学发光检测区中间圆形亲水区域重合；(3) 对电化学发光检测区圆形亲水工作区域进行功能化，首先通过种子溶液生长法生长枝状金纳米粒子，具体生长步骤为：将80 mL二次水加热至90 ℃，并加入0.8 mL 质量分数为1% 的氯金酸溶液，继续加热至96 ℃保持1 min，最后加入2.8 mL 质量分数为1%的柠檬酸钠，并加热5 min后冷却至室温；取20 μL上述溶液滴加到电化学发光检测区圆形亲水工作区域，自然晾干后重复上述操作一次；继续滴加20 μL由0.018 g盐酸羟胺，1.0 mL二次水和667 μL质量分数为1%的氯金酸溶液组成的混合溶液，自然晾干后重复上述操作一次；(4)在电化学发光检测区圆形亲水工作区域修饰氧化石墨烯‑Ag‑N‑(4‑氨丁基)‑N‑乙基异鲁米诺纳米复合物，具体步骤为：将1.0 mL 0.02 mol/L N‑(4‑氨丁基)‑N‑乙基异鲁米诺快速加入由2.0 mL 10 mmol/L硝酸银溶液，500 μL 2.0 mg/mL氧化石墨烯溶液，5.0 mL二次水，9.0 mL乙醇组成的混合溶液并于室温磁力搅拌下反应12小时，将得到的溶液用乙醇和二次水洗涤数次得到氧化石墨烯‑Ag‑N‑(4‑氨丁基)‑N‑乙基异鲁米诺纳米复合物，取20 μL滴加到金纳米粒子修饰的工作区域并自然晾干；(5) 在电化学发光检测区圆形亲水工作区域继续修饰硫化镉量子点以及DNA链3，具体步骤为：首先，将172 μL巯基丙酸加入40 mL 20 mmol/L的氯化镉溶液中并用1 mol/L的氢氧化钠溶液调节其pH为10，继续加入20 mL 20 mmol/L的硫代乙酰胺，并持续搅拌30 min后于80 ℃回流10 h，得到的CdS胶体于室温下透析24 h得到硫化镉量子点；依次滴加20 μL硫化镉量子点，15 μL质量分数为0.05 %的壳聚糖固定液于电化学发光检测区圆形亲水工作区域并自然晾干；继续滴加20 μL DNA链3溶液并于37 ℃保持1小时后4 ℃保存24 h；最后用10 mmol/L pH 8.0的缓冲溶液冲洗工作区域以除去多余的DNA链3，所述的DNA链3碱基序列如核苷酸序列表所示，其中其3’端修饰上巯基和6个亚甲基；(6) 在比色区圆形亲水区域修饰DNA链1与Au纳米立方体‑辣根过氧化物酶‑DNA链2‑HKUST‑1@Pt纳米粒子复合物，具体步骤为：称取0.545 g三水合硝酸铜溶解在7.5 mL二次水中，称取0.264 g均苯三甲酸溶解在7.5 mL乙醇中，使其完全溶解，将上述得到的两种溶液混合并于室温下磁力搅拌30 min得到均匀溶液，将其于120 ℃反应24 h，冷却至室温，用乙醇和二次水洗涤数次，并于80 ℃真空状态下保持10小时得到金属有机框架材料HKUST‑1，HKUST‑1为Cu3(BTC)2, BTC代表均苯三甲酸；取1 mL质量分数为1%的氯铂酸加入1 mL 1 mg/mL 的HKUST‑1中并超声处理20 min,取2 mL 0.1 mol/L硼氢化钠溶液逐滴加入上述混合溶液并剧烈搅拌30 min，最后，将得到的溶液以12000 rpm离心10 min并用二次水洗涤三次得到HKUST‑1@Pt纳米粒子；将0.15 mL 0.1 mol/L硼氢化钠溶液于4 ℃保存3 h后快速加入由6.25 mL 1.0 mmol/L 氯金酸溶液和18.75 mL 0.1 mol/L十六烷基三甲基溴化铵溶液组成的混合溶液中，得到黄褐色溶液,将其于室温磁力搅拌下反应4 h，得到Au种子溶液；将5.0 μL Au种子溶液，50 μL 0.01 mol/L硫酸铜溶液，3.0 mL 0.1 mol/L新制备的抗坏血酸溶液依次加入到由5.0 mL 2.0 mmol/L氯金酸溶液和20 mL 0.02 mol/L十六烷基三甲基溴化铵组成的混合溶液中，溶液在5 min后变为紫红色，将得到的溶液以12000 rpm离心10 min并用二次水洗涤两次，得到Au纳米立方体；取40 μL 5 μmol/L DNA链2与1.0 mL pH 5.2的缓冲溶液，1.5 μL 10 mmol/L三（2‑羧乙基）膦混合并保持1 h；将上述混合溶液与500 μL Au纳米立方体溶液混合并磁力搅拌1 h；将得到的溶液与80 μL 1 mg mL‑1 辣根过氧化物酶混合并于室温下磁力搅拌1.5 h得到Au纳米立方体‑辣根过氧化物酶‑DNA链2复合物；将上述复合物与1.0 mL HKUST‑1@Pt纳米粒子混合并于室温下磁力搅拌16 h后于4℃保持4 h，最后用乙醇和二次水洗涤数次得到Au纳米立方体‑辣根过氧化物酶‑DNA链2‑ HKUST‑1@Pt纳米粒子复合物；取20 μL由60 μL 1 μmol/L DNA链1，500 μL pH 8.0的缓冲溶液，500 μL 1 mM三（2‑羧乙基）膦组成的混合溶液与20 μL Au纳米立方体‑辣根过氧化物酶‑DNA链2‑ HKUST‑1@Pt纳米粒子复合物混合并加热到95 °C以形成Mg2+ 特异性DNA酶；将纸器件比色区沿虚线部分进行切割，沿实线部分进行折叠，取15 μL上述溶液滴加到比色区圆形亲水区域并于室温下保持1.5 h，继续滴加20 μL含有镁离子的待测溶液并于37 °C保持0.5 h以完成镁离子与其特异性DNA酶之间的特异性识别，由于材料粒径和纸纤维孔径大小不同，连接有Au‑辣根过氧化物酶的DNA链2序列能渗透纸芯片实现与DNA链3碱基互补配对，所述的DNA链1碱基序列如核苷酸序列表所示，其中其5’端修饰上氨基和6个亚甲基，DNA链2碱基序列如核苷酸序列表所示，其中其5’端修饰上巯基，3’端修饰上氨基和6个亚甲基，且自左向右第23个碱基A代表腺嘌呤核糖核酸；(7) 取20 μL 20 mmol/L 3，3’‑二氨基联苯胺滴加于比色区矩形亲水显色条，连接有HKUST‑1@Pt纳米粒子的DNA链2序列由于粒径大于纸纤维孔径不能透过纸芯片，继续向比色区圆形亲水工作区域滴加20 μL 5 mmol/L H2O2，反应5 min后滴加40 μL pH 8.0的缓冲溶液，液体流入显色条，10 min后测量显色长度；(8) 将纸器件电化学发光检测区下方矩形区域沿虚线部分进行切割，沿实线部分进行折叠使矩形亲水区域与圆形亲水区域对齐，将20 μL 10 mmol/L双氧水与40 μL pH 8.0的缓冲溶液混合滴加到矩形亲水区域，连接电化学工作站检测镁离子浓度；(9) 分别绘制电化学发光强度和显色长度与镁离子浓度的标准曲线，完成镁离子的测定。
所属类别：	发明专利