详情

原文传递一种筛选四逆汤抗心肌缺血药效物质基础的方法

专利名称：	一种筛选四逆汤抗心肌缺血药效物质基础的方法
摘要：	本发明公开了一种筛选四逆汤抗心肌缺血药效物质基础的方法，包括以下步骤：一、四逆汤抗心肌缺血的内源性代谢物的确定和峰面积的测定；二、四逆汤体内移行成分的确定和峰面积的测定；三、四逆汤抗心肌缺血的内源性代谢物的峰面积与四逆汤体内移行成分的峰面积的相关性分析，筛选出四逆汤抗心肌缺血药效物质基础。本发明基于异丙肾上腺素致大鼠心肌缺血模型，采用超高效液相色谱‑四极杆‑飞行时间质谱的非靶向代谢组学技术和基于超高效液相色谱‑三重四极杆质谱靶向代谢组学技术，筛选出12种四逆汤抗心肌缺血药效物质基础，提高了四逆汤抗心肌缺血药效物质基础的准确性，缩短了筛选周期，减少了筛选耗费成本。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	陕西;61
申请人：	中国人民解放军第四军医大学
发明人：	谭光国;周倩;孟平;王海波;陈鹏
专利状态：	有效
申请号：	CN201811015131.1
公开号：	CN109115933A
代理机构：	西安创知专利事务所 61213
代理人：	谭文琰
分类号：	G01N30/88(2006.01)I;G;G01;G01N;G01N30
申请人地址：	710032 陕西省西安市新城区长乐西路169号
主权项：	1.一种筛选四逆汤抗心肌缺血药效物质基础的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：步骤一、四逆汤抗心肌缺血的内源性代谢物的确定和峰面积的测定步骤101、确定四逆汤抗心肌缺血的内源性代谢物：步骤1011、四逆汤的制备：分别称取60g附子、40干姜和60g甘草，然后加入1600mL纯净水浸泡1h后煎煮2h，趁热用四层纱布过滤，得到一次滤液和一次残渣，向一次残渣中加入1200mL纯净水煎煮1h，再次趁热用四层纱布过滤，得到二次滤液和二次残渣，合并一次滤液和二次滤液，经减压浓缩后得到浓度为1g/mL的四逆汤，即每毫升四逆汤相当于附子0.375g，干姜0.25g，甘草0.375g；步骤1012、样品的采集与制备：取雄性SD大鼠分成三组，分别为空白组、模型组和模型给药组，其中模型给药组口服给予四逆汤，四逆汤剂量为10mL溶液/1000g大鼠体重，空白组和模型组口服给予同体积生理盐水，各组每日灌胃给药1次，连续10d，在第9d和第10d对模型给药组和模型组腹腔注射异丙肾上腺素制备心肌缺血模型，异丙肾上腺素剂量为85mg/1000g大鼠体重，对空白组腹腔注射同体积的生理盐水，各组每日注射1次，最后一次注射后的2h和4h时，各组均大鼠眼眶取血，然后在4℃、3000×g的条件下离心10min，得到的上清液为血清样品，将各组血清样品均在‑70℃下保存；步骤1013、样品分析：将步骤1012中得到的各组血清样品冻融后各取100μL，分别加入400μL含有12.5μg/mL内标物L‑2‑氯丙苯氨酸的甲醇涡旋1min，然后均置于冰水浴中超声提取10min，再在4℃、14000×g的条件下离心15min，得到的上清液采用超高效液相色谱/四极杆‑飞行时间质谱进行检测分析，得到各组血清样品的数据，其中超高液相色谱分析的条件为：超高液相色谱采用Agilent1290 Infinity液相色谱系统，色谱柱填料使用ACQUITY UPLC HSS T3 C18，规格为2.1mm×100mm，1.7μm，柱温为40℃，流动相中的A相为甲酸质量含量0.1％的甲酸水溶液，B相为甲酸质量含量0.1％的甲酸乙腈溶液，流速为400μL/min，进样量为4μL，其中质谱条件为：质谱采用Agilent 6530 Accurate‑Mass Quadrupole Time‑of‑Flight(Q‑TOF)质谱仪，采用正离子模式检测，检测参数中的毛细管电压为3500V，干燥气流速为11L/min，干燥气温度为350℃，喷雾气压为45psig，破碎电压为120V，锥孔电压60V，数据采集范围质荷比m/z为50～1000；步骤1014、四逆汤抗心肌缺血的内源性代谢物的确定：首先根据步骤1013中各组血清样品的数据，对比空白组与模型组的内源性代谢物的变化，采用正交偏最小二乘法分析并确定模型组异常变化的内源性代谢物，然后以模型组异常变化的内源性代谢物为潜在的药效指标，对比模型组与模型给药组的异常变化的内源性代谢物，采用方差分析法分析四逆汤干预后异常变化的内源性代谢物中明显逆转的代谢物，确定了四逆汤抗心肌缺血的内源性代谢物；所述明显逆转的代谢物的方差分析结果中p<0.05；步骤102、四逆汤抗心肌缺血的内源性代谢物的峰面积的测定：步骤1021、采用超高效液相色谱/三重四极杆质谱，通过多反应监测模式对步骤1014中确定的13种四逆汤抗心肌缺血的内源性代谢物的特征离子进行扫描，得到相应的谱图；步骤1022、通过定量分析软件MassHunter Quantitative Analysis对步骤1021中得到的相应的谱图中的色谱峰面积进行积分，得到四逆汤抗心肌缺血的内源性代谢物的含量信息；步骤二、四逆汤体内移行成分的确定和峰面积的测定步骤201、四逆汤体内移行成分的确定：根据步骤1013中各组血清样品的数据，分别建立空白组与模型组间的正交偏最小二乘法判别分析模型和空白组与模型给药组间的正交偏最小二乘法判别分析模型，然后以空白组与模型组间的正交偏最小二乘法判别分析模型权重载荷因子为横坐标，以空白组与模型给药组的正交偏最小二乘法判别分析模型权重因子为纵坐标，应用Simca‑p统计软件(version 14.1)构建SUS‑plot即共享独特结构图，筛选四逆汤在模型给药大鼠体内的移行成分，确定落在纵坐标轴正方向上的变量为四逆汤在模型给药大鼠体内的移行成分；步骤202、四逆汤体内移行成分的峰面积的测定：步骤2021、采用超高效液相色谱/三重四极杆质谱，通过多反应监测模式对步骤201中确定的四逆汤体内移行成分的特征离子进行扫描，得到相应的谱图；步骤2022、通过定量分析软件MassHunter Quantitative Analysis对步骤2021中得到的相应的谱图中的色谱峰面积进行积分，得到四逆汤体内移行成分的含量信息；步骤三、四逆汤抗心肌缺血的内源性代谢物的峰面积与四逆汤体内移行成分的峰面积的相关性分析：将步骤1022中得到的四逆汤抗心肌缺血的内源性代谢物的含量信息与步骤2022中得到的四逆汤体内移行成分的含量信息进行Pearson相关分析，用相关系数r表示四逆汤体内移行成分对四逆汤抗心肌缺血的内源性代谢物的作用程度，其中\|r\|≥0.6表示显著相关，从而筛选出四逆汤抗心肌缺血药效物质基础。
所属类别：	发明专利