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原文传递一种基于蛋白质组学鉴别古代毛织品残片毛种类的方法

专利名称：	一种基于蛋白质组学鉴别古代毛织品残片毛种类的方法
摘要：	本发明涉及文物检测领域，公开了一种基于蛋白质组学鉴别古代毛织品残片毛种类的方法，具体为：取等量已经混淆的古代山羊毛、绵羊毛、骆驼毛织品样品，用金属盐法和还原法提取角蛋白，分别进行SDS‑PAGE凝胶电泳分离蛋白，用反相微乳液法制备碳量子点溶液作为染色液。将条带酶解，采用HPLC‑MS/MS质谱分析，根据质谱检测得到的氨基酸序列与氨基酸序列数据库对比，鉴定古代毛织品属于山羊毛、绵羊毛还是骆驼毛。这种古代毛织品的检测方法具有凝胶电泳图像清晰，溶解率和提取效率高等优点，非常适合用于年代早、肉眼难以识别的古代毛织品残片不同目科属种的毛种类的鉴定。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	浙江;33
申请人：	浙江理工大学
发明人：	王秉;王钟元;朱诚;胡铭周;彭志勤;胡智文
专利状态：	有效
申请号：	CN201810969919.X
公开号：	CN109239170A
代理机构：	嘉兴永航专利代理事务所(普通合伙) 33265
代理人：	侯兰玉
分类号：	G01N27/447(2006.01)I;G;G01;G01N;G01N27
申请人地址：	310018 浙江省杭州市下沙高教园区2号大街浙江理工大学
主权项：	1.一种基于蛋白质组学鉴别古代毛织品残片毛种类的方法，其特征在于，以g和mL计，包括如下步骤：1）称取等量已混淆的古代山羊毛、绵羊毛、骆驼毛织品，用去离子水反复清洗，去除表面污渍， 30‑35℃真空烘干，分别记为A、B、C三组；2）将步骤1）烘干的A、B、C三组样品，分别浸没在pH =1.5‑2.5的草酸溶液中，静置1‑2h，用去离子水搓洗至中性，30‑35℃真空烘干；3）将步骤2）烘干的A、B、C三组样品，以1：15‑25的浴比加入含有0.05‑0.15mol/L LiBr和0.02‑0.04mol/L 十二烷基硫酸钠的溶液中浸没，调节pH值到8‑11，40‑50℃下以190‑210W的功率超声30‑50min后，放入微波反应器辐射水解6‑8min；4）从反应器中取出，倒入三口烧瓶，将三口烧瓶放在恒温水浴锅中，调节水浴温度70‑90℃，通氮气10‑20分钟，排除氧气，缓缓加入10‑25ml的2.5‑3.5 mol/L 三(2‑羧乙基)膦溶液，通氮气搅拌，使毛溶解，真空抽滤，去除未溶毛及杂质；5）在4‑8℃下，加入无水甲醇，反复浸泡，使蛋白析出，滤出蛋白后，加入去离子水溶解，在2‑6℃条件下用透析袋透析，前9‑12h，每隔1‑2h换一次水，第12‑ 24h每隔2‑5h换一次水，第24‑48h每隔5‑10h换一次水，第48‑72h，每隔10‑15h换一次水，除去表面活性剂、金属盐等杂质；低温真空浓缩至原体积的1/4‑1/2，得到角蛋白提取液A、B、C；6）向15‑30 m L正己烷中加入摩尔比为18‑22:1的水和十二烷基苯磺酸钠，制得油相溶液；7）向步骤6）所得油相溶液中，加入质量分数为45‑55%的生物质焦油水溶液，再加入摩尔比为1.8‑2.2:1的正戊醇和十二烷基苯磺酸钠，用力摇晃，溶液变淡黄色，即得到反相微乳液，于室温静置10‑13h；8）向步骤7）所得反相微乳液中加入0.2‑0.4 g十二胺，室温下超声8‑12 min；然后向含聚四氟乙烯内胆的反应釜内倒入超声后的混合溶液，在110‑130℃马弗炉中放置2‑4 h，取出，自然冷却至室温；用无水丙醇破乳，洗涤数次，离心，制得碳量子点原始溶液；9）用柠檬酸将0.02‑0.04 mol/L的柠檬酸钠溶液的pH调为2.5‑2.8，将此溶液与350‑450μl步骤8）所得碳量子点原始溶液混合均匀，制得碳量子点染胶溶液；10)组装制胶器，灌注分离胶，加入纯化水，待分离胶的胶面与水形成可见的界面时，轻轻倒出纯化水，擦干纯化水后插上梳子，注入浓缩胶；待浓缩胶完全聚合后，将梳子轻轻拔出；11)取角蛋白提取液A、B、C于2*样品缓冲液按1∶0.8‑1.2比例混合，水浴加热于93‑97℃下加热1.5‑2.5 min，使蛋白质变性并确保结合最大量的十二烷基硫酸钠；样品冷却至室温后，分别取10‑20μl角蛋白提取液A、B、C加入凝胶点样孔，进行SDS‑PAGE凝胶电泳；12)电泳完毕后，切断电源，取出凝胶，浸入步骤9）所得碳量子点染胶溶液，以低速在摇床上振荡2.5‑3.5h，放到凝胶成像仪中，观察样品的电泳图像；13)将经步骤12)所得的染色样品的蛋白质条带割下来装入1.0‑2.0ml离心管中，加入300‑400ul去离子水振荡洗涤，吸出液体，重复一次，加入含10‑30％甲醇、4‑8%甘油、8‑12％乙酸的脱色液40‑70ul，静置2‑4min，用去离子水终止反应并重复洗涤一次，吸出多余的液体；加入180‑220ul 35‑45mmol/L碳酸氢铵溶液振荡洗涤2‑4min，重复一次；加入110‑160 ul乙腈振荡，待胶块变白，吸弃乙腈，置于真空浓缩仪中干燥8‑12min；14)向步骤13)所得的离心管中加入50‑80ul的胰蛋白酶溶液，完全盖住胶粒冰浴40‑50min，使胶粒吸收酶解液溶胀，然后在35‑40℃烘箱中孵育13‑15h进行酶解；15)采用HPLC‑MS/MS对样品A、B、C进行质谱分析，根据质谱检测得到的氨基酸序列与三种毛的氨基酸序列数据库对比，若样品符合山羊毛氨基酸序列，为山羊毛织品；若样品符合绵羊毛氨基酸序列，则为绵羊毛织品；若样品符合骆驼毛氨基酸序列，则为骆驼毛织品。
所属类别：	发明专利