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原文传递一种转录因子免疫共沉淀（ChIP）试剂配方

专利名称：	一种转录因子免疫共沉淀（ChIP）试剂配方
摘要：	本发明涉及一种转录因子免疫共沉淀(ChIP)试剂配方，本发明的有益成果为：本发明提供的一种转录因子免疫共沉淀(ChIP)试剂配方，本发明的方法针对转录因子，进行免疫共沉淀实验，通过各种配方的分别测试，一一排查，最后得到合适的制取成分。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	江苏;32
申请人：	苏州同因生物科技有限公司
发明人：	李旦
专利状态：	有效
申请号：	CN201710660252.0
公开号：	CN109387624A
分类号：	G01N33/531(2006.01)I;G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	215500 江苏省苏州市常熟高新技术产业开发区湖山路333号同济科技广场1幢2004
主权项：	1.一种转录因子免疫共沉淀(ChIP)试剂配方，其特征在于，包含以下内容：1.RIPA Buffer配制基础成分：Tris‑HCl(缓冲液成分，防止蛋白变性)NaCl(盐份，防止非特异蛋白聚集)NP‑40(非离子去污剂，提取蛋白；用H2O配制成10％储存液)去氧胆酸钠(离子去污剂，提取蛋白；用H2O配制成10％储存液；避光保存)注意：准备激酶(致活酶)实验时，不要加去氧胆酸钠，因为离子型去污剂能够使酶变性，导致活性丧失。RIPA蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟(PMSF)(用异丙醇配制成200mM的储存液，室温保存)EDTA(钙螯合剂；用H2O配制成100mM的储存液，PH7.4)亮抑酶肽(Leupeptin)(用H2O配制成1mg/ml的储存液，分装，‑20℃保存)抑蛋白酶肽(Aprotinin)(用H2O配制成1mg/ml的储存液，分装，‑20℃保存)胃蛋白酶抑制剂(Pepstat in)(用甲醇配制成1mg/ml的储存液，分装，‑20℃保存)RIPA磷酸(酯)酶抑制剂激活的Na3VO4(用H2O配制成200mM的储存液)NaF(200mM的储存液，室温保存)注意：在准备做磷酸(酯)酶实验的时候，不加磷酸酯酶抑制剂；2.工作液配制配制100ml的modified RIPA buffer：1)称取790mg的Tris‑Base，加到75ml去离子水中，加入900mg的NaCl，搅拌，直到全部溶解，用HCl调节PH值到7.42)加10ml 10％的NP‑403)加2.5ml 10％的去氧胆酸钠，搅拌，直到溶液澄清4)加1ml 100mM的EDTA，用量筒定容到100ml，2‑8℃保存5)理论上，蛋白酶和磷酸酯酶抑制剂应该在使用当天同时加入(抑蛋白酶肽，亮抑酶肽，胃蛋白酶抑制剂各100μl；PMSF，Na3VO4，NaF各500μl)，但是PMSF在水溶液中很不稳定，30分钟就会降解一半，所以PMSF应该在使用前现加，其他抑制剂成分可以在水溶液中稳定5天。各种成分在工作液中的终浓度：a.Tris‑HCl：50mM，pH 7.4b.NP‑40：1％c.去氧胆酸钠：0.25％d.NaCl：150mM e.EDTA：1mM f.PMSF：1mM g.抑蛋白酶肽，亮抑酶肽，胃蛋白酶抑制剂：各1μg/ml h.Na3VO4：1mM i.NaF：1mM实验步骤准备工作：1.预冷PBS，RIPA Buffer，细胞刮子(用保鲜膜包好后，埋冰下)，离心机；2.用预冷的PBS洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS；3.加入预冷的RIPA Buffer(1ml/107个细胞、10cm培养皿或150cm2培养瓶，0.5ml/5×106个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶)；4.用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到1.5EP管中，4℃，缓慢晃动15min(EP管插冰上，置水平摇床上)；5. 4℃，14000g离心15min，立即将上清转移到一个新的离心管中；6.准备Protein A agarose，用PBS洗两遍珠子，然后用PBS配制成50％浓度，建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠；7.每1ml总蛋白中加入100μl Protein A琼脂糖珠(50％)，4℃摇晃10min(EP管插冰上，置水平摇床上)，以去除非特异性杂蛋白，降低背景；8. 4℃，14000g离心15min，将上清转移到一个新的离心管中，去除Protein A珠子；9.(Bradford法)做蛋白标准曲线，测定蛋白浓度，测前将总蛋白至少稀释1：10倍以上，以减少细胞裂解液中去垢剂的影响(定量，分装后，可以在‑20℃保存一个月)；10.用PBS将总蛋白稀释到约1μg/μl，以降低裂解液中去垢剂的浓度，如果兴趣蛋白在细胞中含量较低，则总蛋白浓度应该稍高(如10μg/μl)；11.加入一定体积的兔抗到500μl总蛋白中，抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的多少而异；12. 4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h，激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2h室温孵育；13.加入100μl Protein A琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物，4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1h，如果所用抗体为鼠抗或鸡抗，建议加2μl“过渡抗体”(兔抗鼠IgG，兔抗鸡IgG)；14. 14000rpm瞬时离心5s，收集琼脂糖珠‑抗原抗体复合物，去上清，用预冷的RIPA buffer洗3遍，800μl/遍，RIPA buffer有时候会破坏琼脂糖珠‑抗原抗体复合物内部的结合，可以使用PBS；15.用60μl 2×上样缓冲液将琼脂糖珠‑抗原抗体复合物悬起，轻轻混匀，缓冲液的量依据上样多少的需要而定(60μl足够上三道)；16.将上样样品煮5min，以游离抗原，抗体，珠子，离心，将上清电泳，收集剩余琼脂糖珠，上清也可以暂时冻‑20℃，留待以后电泳，电泳前应再次煮5min变性。通过免疫共沉淀确定结合蛋白：1.用磷酸盐缓冲液洗30块10cm培养板上的适宜细胞。刮去每块板上的细胞到1ml冰冷的EBC裂解缓冲液中；2.将每毫升细胞悬液转移到微量离心管中，在微量离心机上4℃以最大速度离心15min；3.收集上清(约30ml)并加入30μg的适当抗体，4℃摇动免疫沉淀物1h；4.加入0.9ml的蛋白质A‑Sepharose悬液，4℃摇动免疫沉淀物30min；5.用含900mmol/L NaCl的NETN洗蛋白A‑Sepharose混合物，再重复洗5次。最后，用NETN洗一次；6.吸出混合物的液体部分。加入800μl的1×SDS胶加样缓冲液到球珠中，煮沸4min；7.将样品加入到大孔的不连续SDS‑PAGE梯度胶中，在10mA的恒定电流下电泳过夜；8.通过考马斯蓝染色观察蛋白质泳带；9.从胶上切下目标带，将其放到微量离心管中，用1ml 50％乙腈洗两次，每次3min；10.用胰蛋白酶消化胶中的蛋白质，再将肽电洗脱；11.通过窄孔高效液相色谱分离肽。将收集的肽在ABI 477A或494A机器上进行自动Edman降解测序。
所属类别：	发明专利