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原文传递一种检测加热不燃烧卷烟总粒相物对细胞超氧化物歧化酶活性影响的方法

专利名称：	一种检测加热不燃烧卷烟总粒相物对细胞超氧化物歧化酶活性影响的方法
摘要：	本发明公开一种检测加热不燃烧卷烟总粒相物对细胞超氧化物歧化酶活性影响的方法，包括以下步骤：(1)样品前处理；(2)人鼻腔上皮细胞单细胞悬浮液的制备；(3)人鼻腔上皮细胞单细胞悬浮液的细胞浓度计算；(4)人鼻腔上皮细胞单细胞悬浮液的接种；(5)受试物暴露；(6)收集细胞；(7)细胞裂解；(8)(8)样品测定；(9)超氧化物歧化酶酶活力计算。本发明样品的有效处理、检测剂量的优化设定以及靶细胞的正确选择，使得本方法能够准确检测加热不燃烧卷烟总粒相物对超氧化物歧化酶酶活力的影响，进而能够有效地评价加热不燃烧卷烟总粒相物对细胞的氧化性损伤的影响。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	云南;53
申请人：	云南中烟工业有限责任公司
发明人：	管莹;李雪梅;汤建国;朱东来;张霞;韩敬美;何东沅;张伟;高茜;徐玉琼
专利状态：	有效
申请号：	CN201811433499.X
公开号：	CN109444126A
代理机构：	北京市领专知识产权代理有限公司 11590
代理人：	任文娟;陈有业
分类号：	G01N21/78(2006.01)I;G;G01;G01N;G01N21
申请人地址：	650231 云南省昆明市五华区红锦路367号
主权项：	1.一种检测加热不燃烧卷烟总粒相物对细胞超氧化物歧化酶活性影响的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)样品前处理：采用直线型吸烟机，在抽吸容量为55.0mL，持续时间3s，抽吸频率为30s的抽吸条件下，连续抽吸10口，用直径为44mm的剑桥滤片捕集，分别于抽吸前、抽吸后称量烟气捕集器的质量，按照公式(1)计算加热不燃烧卷烟总粒相物的质量mTPM；mTPM＝m1‑m0 (1)式中：m0——抽吸前烟气捕集器的质量，单位为毫克(mg)；m1——抽吸后烟气捕集器的质量，单位为毫克(mg)；捕集完毕后，将捕集后的剑桥滤片放入50mL的三角瓶中，加入二甲基亚砜，使加热不燃烧卷烟总粒相物在二甲基亚砜中的浓度为40mg/mL；将此三角瓶置于超声仪上超声30min；再用无菌滤纸过滤收集二甲基亚砜萃取液，分装至1mL的冻存管中，‑80℃保存待用；(2)人鼻腔上皮细胞单细胞悬浮液的制备：人鼻腔上皮细胞RPMI2650复苏后，接种到25cm2细胞培养瓶中，加入10mLRPMI1640细胞培养基，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，倒置显微镜观察培养细胞的汇合和形态情况，待细胞长至70％～90％的汇合率时，移除培养瓶中的RPMI1640细胞培养基，用磷酸缓冲液洗两次，弃洗液；加入1mL 0.25％(w/v)的胰蛋白酶溶液单层孵育1～2min，用RPMI1640细胞培养基悬起，形成单细胞悬浮液；(3)人鼻腔上皮细胞单细胞悬浮液的细胞浓度计算：用血球计数板计数法对步骤(2)所得人鼻腔上皮细胞单细胞悬浮液的细胞浓度进行计算，得到每毫升单细胞悬浮液的活细胞数；(4)人鼻腔上皮细胞单细胞悬浮液的接种：将步骤(3)计数后的人鼻腔上皮细胞单细胞悬浮液用RPMI1640细胞培养基稀释至2.0×105个/mL，接种到100mm细胞培养皿中，每皿6mL，然后将细胞培养皿置于37℃、5％CO2培养箱内培养24h；(5)受试物暴露：把步骤(1)中制备的样品用PBS稀释成400μg/mL的工作液备用，取出细胞培养皿，去除细胞培养液，将不同剂量的待测液加入细胞培养皿中，每个剂量设3个复孔，置于37℃，5％CO2培养箱中培养24h；(6)收集细胞：移除步骤(5)细胞培养皿中的培养基，细胞用PBS磷酸盐缓冲液洗一遍，加入质量浓度0.25％的胰蛋白酶溶液；每孔中的细胞用RPMI1640细胞培养基悬起，分别收集到15mL离心管中，1000rpm，4℃条件下离心10min，去上清液；(7)细胞裂解：步骤(6)中每支离心管中加入100μL细胞裂解液，0℃冰浴1min，1600rpm，4℃条件下离心10min，取上清液待测；(8)样品测定：在不同的离心管内加入20μL待测上清液作为检测样品组，空白对照1加入20μL检测缓冲液，空白对照2加入40μL检测缓冲液；检测样品组和空白对照组还分别加入180μL氮蓝四唑显色工作液，37℃下孵育30分钟，于560nm测定吸光度；(9)超氧化物歧化酶酶活力计算：a.根据步骤(8)所得吸光度值计算抑制百分率，抑制百分率＝(A空白对照1－A样品)/(A空白对照1－A空白对照2)×100％；b.SOD酶活力的计算：待测样品中SOD酶活力单位＝抑制百分率/(1－抑制百分率)units。
所属类别：	发明专利