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原文传递基于线粒体膜电位变化检测网织红细胞的方法

专利名称：	基于线粒体膜电位变化检测网织红细胞的方法
摘要：	本发明提供一种基于线粒体膜电位变化检测网织红细胞的方法，具体步骤如下：1）取血液样品，经PBS调整细胞浓度后，待用；2）将MTG加入样品中摇匀；加入TMRE混匀；加入Hoechst33342混匀；孵育箱孵育；3）完成孵育后的样品离心清洗两次，经PBS重悬后上流式细胞仪检测，或取样品静置待细胞沉淀后上激光共聚焦检测；4）将检测数据用软件分析，得到不同成熟度的网织红细胞情况。相比手动计数法，数据重复性好；相比单纯流式细胞仪检测，计数更为准确，重复性高，同时增加了流式细胞仪测量的灵敏度。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	广东;44
申请人：	广东药科大学
发明人：	薄华本;陈俊;杜瑞蓝
专利状态：	有效
申请日期：	2019-05-21T00:00:00+0800
发布日期：	2019-08-02T00:00:00+0800
申请号：	CN201910426066.X
公开号：	CN110082265A
代理机构：	广州专理知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：	谭昉
分类号：	G01N15/00(2006.01);G;G01;G01N;G01N15
申请人地址：	510000 广东省广州市大学城外环东路280号
主权项：	1.一种基于线粒体膜电位变化检测网织红细胞的方法，其特征在于，具体步骤如下：取血液样品，经PBS调整细胞浓度后，待用；将MTG加入样品中摇匀；加入TMRE混匀；加入Hoechst33342混匀；孵育；完成孵育后的样品离心清洗两次，经PBS重悬后上流式细胞仪检测，或取样品静置待细胞沉淀后上激光共聚焦检测；将检测数据用软件分析，得到不同成熟度的网织红细胞情况。 2.根据权利要求1所述的基于线粒体膜电位变化检测网织红细胞的方法，其特征在于，所述血液样品来自外周血、骨髓或脾脏。 3.根据权利要求2所述的基于线粒体膜电位变化检测网织红细胞的方法，其特征在于，所述血液样品为外周血，取100μL全血加入含15 g/L EDTA的PBS中并调整细胞浓度约1×106-2×106个/mL；所述血液样品来自骨髓，在无菌超净台中解剖取出2条股骨，用已高压消毒的剪刀剪去股骨两端的小部分关节，修剪干净骨骼周围的组织，先用PBS洗一次骨头，单支股骨用1mL一次性注射器吸取1mL含有2%胎牛血清的PBS，迅速小心将针头插入股骨末端，分别冲洗出股骨里面的骨髓细胞，用200目滤网过滤并制成单细胞悬液，吸取并调整细胞浓度约1×106-2×106个/mL；所述血液样品来自脾脏，在无菌超净台中用已高压消毒的剪刀解剖取出脾脏，置于100目筛网中，用1mL一次性注射器弃去针头，轻柔碾压脾脏后过滤，用含有2%胎牛血清的PBS反复冲洗筛网并制成单细胞悬液，调整细胞浓度约1×106-2×106个/mL。 4.根据权利要求1所述的基于线粒体膜电位变化检测网织红细胞的方法，其特征在于，步骤2）中，取10μL MTG（工作液浓度10μM）加入样品（终体积为100μL，细胞浓度约1×106-2×106个/mL）中摇匀，加入20μL TMRE（工作液浓度300μM）于样品中摇匀，加入1μLHoechst33342（工作液浓度1mg/mL）混匀，置于37℃孵育箱孵育2-2.5h。 5.根据权利要求1所述的基于线粒体膜电位变化检测网织红细胞的方法，其特征在于，步骤3）中，所述离心条件为300g，离心5min。 6.根据权利要求1所述的基于线粒体膜电位变化检测网织红细胞的方法，其特征在于，步骤3）中，所述流式细胞仪为具有三激光十通道的流式细胞仪。 7.根据权利要求6所述的基于线粒体膜电位变化检测网织红细胞的方法，其特征在于，所述流式细胞仪的设门步骤如下：（1）使用SS和FS确定细胞群，排除血小板、细胞碎片；（2）使用Cascede Blue通道信号设门排除有核细胞群干扰；（3）使用FITC（获取MTG荧光信号）和PE（获取TMRE荧光信号）通道设门标记网织红细胞及其不同成熟期分群；每样本至少检测30000个细胞。 8.根据权利要求7所述的基于线粒体膜电位变化检测网织红细胞的方法，其特征在于，所述流式细胞仪的设门条件中，Hoechst33342的激发光在346nm，发射光波长在460±15nm；MTG的激发光在488nm，发射光在515±15nm；TMRE的激发光在543nm，发射光在605±32.5nm。 9.根据权利要求1所述的基于线粒体膜电位变化检测网织红细胞的方法，其特征在于，所述激光共聚焦检测的条件为：用激光共聚焦激光346nm、488nm和543nm激发，发射波长包括460±15nm、515±15nm和605±32.5nm；激光共聚焦的透射光设置在TD1模式，在蓝色、红色和绿色通道中，采集图像。 10.根据权利要求1所述的基于线粒体膜电位变化检测网织红细胞的方法，其特征在于，所述流式细胞术的数据用EXPO32 TM ADC软件分析；激光共聚焦数据用FV10-ASW软件分析；所述软件分析过程如下：对数据进行正态分布检验和方差齐性检验，样本均采用平均值±标准差（mean±SD）表示，每个样本重复3次。
所属类别：	发明专利