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原文传递一种基于钴纳米材料/核酸适配体的复合探针荧光“开-关-开”策略检测脑钠肽的方法

专利名称：	一种基于钴纳米材料/核酸适配体的复合探针荧光“开-关-开”策略检测脑钠肽的方法
摘要：	本发明公开了一种基于钴纳米材料/核酸适配体的复合探针荧光“开‑关‑开”策略检测脑钠肽的方法，首先合成了具有高效荧光猝灭作用的羟基氧化钴(CoOOH)纳米环，然后通过构建CoOOH纳米环/FAM‑aptamer复合探针，利用CoOOH纳米环对染料的荧光猝灭作用，降低背景信号；再利用BNP对FAM‑aptamer的特异性分子识别作用使荧光染料远离CoOOH纳米环，从而使荧光信号恢复。荧光恢复效率与BNP浓度在0.030‑0.80pg/mL范围内的线性关系良好，具有简单、快速、高灵敏、高特异性等优点，可用于临床标本中BNP定量检测。ROC曲线分析表明本方法诊断心衰的准确性较高(AUC＝0.87，95％CI:0.71‑1.00，P<0.01)，特异性好(诊断特异性为87.9％)。此外，本方法使用成本大大降低，适宜在基层儿童、成人心衰诊断及预后中广泛推广和使用。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	重庆;50
申请人：	重庆医科大学
发明人：	张普;涂爱萍;尚京川;尹一兵;袁川吉
专利状态：	有效
申请日期：	2019-05-23T00:00:00+0800
发布日期：	2019-08-06T00:00:00+0800
申请号：	CN201910432282.5
公开号：	CN110095616A
分类号：	G01N33/74(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	400016 重庆市渝中区医学院路1号
主权项：	1.一种基于钴纳米材料/核酸适配体的复合探针荧光“开-关-开”策略检测脑钠肽的方法，其特征在于：羟基氧化钴(CoOOH)纳米环能够吸附核酸适配体探针(FAM-aptamer)，形成FAM-aptamer/CoOOH纳米环复合物，CoOOH纳米环与FAM-aptamer间的荧光共振能量转移导致染料荧光猝灭，使背景信号降低，随着脑钠肽(BNP)的加入，BNP与核酸适配体发生特异性分子识别，使核酸适配体的构象改变并脱离CoOOH纳米环表面，染料的荧光信号得以恢复，根据荧光强度变化与BNP浓度的对数呈线性相关，通过拟合标准曲线即可计算临床样品中BNP的含量。 2.根据权利要求1所述的一种基于钴纳米材料/核酸适配体的复合探针荧光“开-关-开”策略检测脑钠肽的方法，其特征在于，包括以下步骤： (1)FAM-aptamer探针的荧光测定：将FAM-aptamer与Tris-HCl缓冲液涡旋混匀后，检测混合溶液的荧光强度； (2)FAM-aptamer/CoOOH纳米环荧光猝灭体系的构建：将FAM-aptamer溶液和CoOOH纳米环分散液及Tris-HCl缓冲液涡旋混匀后，检测并计算混合溶液荧光强度变化与CoOOH纳米环浓度之间的关系，确定CoOOH纳米环的最佳猝灭浓度； (3)FAM-aptamer/CoOOH纳米环检测BNP的线性关系建立：将一定量FAM-aptamer/CoOOH纳米环溶液和Tris-HCl缓冲溶液均匀混合，加入BNP标准溶液，涡旋混匀后，检测并计算混合溶液荧光强度变化与BNP浓度之间的关系，建立相应的荧光恢复线性方程； (4)FAM-aptamer/CoOOH纳米环复合探针检测临床样本中的BNP：将一定量FAM-aptamer/CoOOH纳米环溶液和Tris-HCl缓冲溶液混合均匀，加入BNP临床标本，涡旋混匀后，检测并计算混合溶液的荧光强度变化值并代入步骤(3)构建的线性方程，计算得到临床样本中BNP的含量。 3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的CoOOH纳米环的制备方法为：将10.0mL氢氧化钠溶液(1mol/L)在磁力搅拌下迅速加入到40.0mL六水合氯化钴溶液(0.01mol/L)中，搅拌混匀后，超声1min，在超声过程中逐滴加入2.0mL次氯酸钠(0.9mol/L)，继续超声10min后，用1mol/L盐酸溶液调节溶液pH至7.3，将获得的溶液于10000rpm离心10min，用大量去离子水清洗沉淀以除去多余的反应物，最后60℃烘干，备用。 4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的CoOOH纳米环分散液的制备方法为：CoOOH纳米环经超声分散于超纯水中，浓度为0-18.75μg/mL。 5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的CoOOH纳米环猝灭FAM-aptamer的最佳浓度为18.75μg/mL，涡旋时间为1-2min。 6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的线性方程为Y＝0.18lnX+0.82，R2＝0.9901，检测BNP的线性范围为0.030-0.80pg/mL，对BNP的检测限为0.030pg/mL(3σ)；其中Y为荧光恢复效率，而X为BNP的浓度，单位pg/mL。 7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述Tris-HCl缓冲液的pH为7.4。 8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述用于构建荧光猝灭体系的纳米材料不局限于CoOOH纳米环，其他钴纳米材料(如CoOOH纳米片、Co3O4纳米片和Co3O4纳米环等)都可以用于构建类似的荧光猝灭体系。
所属类别：	发明专利