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原文传递磁性免疫球蛋白-结合粒子

专利名称：	磁性免疫球蛋白-结合粒子
摘要：	本发明公开一种免疫球蛋白‑结合磁珠，其包含多孔基质和一个或多个嵌入所述基质的磁性粒子，其中所述基质包含多孔聚合物和共价偶联于所述多孔聚合物的至少10 mg/ml Fc‑结合蛋白配体。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	瑞典;SE
申请人：	通用电气健康护理生物科学股份公司
发明人：	O.林德;K.格鲍尔;E.法尔德;N.诺曼;R.帕尔姆格兰;J.黑伯格;N.荣内柳斯;K.A.J.林德瑞特;A.索布兰
专利状态：	有效
申请日期：	2017-12-21T00:00:00+0800
发布日期：	2019-08-13T00:00:00+0800
申请号：	CN201780081112.6
公开号：	CN110121646A
代理机构：	中国专利代理(香港)有限公司
代理人：	初明明;黄希贵
分类号：	G01N33/543(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	瑞典乌普萨拉
主权项：	1.一种从细胞培养物中分离目标生物分子的方法，其包括以下步骤： a) 提供多个能够结合所述目标生物分子的磁珠； b) 使所述多个磁珠与包含目标生物分子的细胞培养物接触，以使所述目标生物分子与所述珠结合； c) 用磁场保留所述珠并用洗涤液洗涤所述珠； d) 用洗脱剂洗脱所述珠以从所述珠解吸所述目标生物分子并回收洗脱液中的所述目标生物分子。 2.权利要求1的方法，其中在步骤c)之前，所述磁珠被传送到高梯度磁场分离器(HGMS)并在所述高梯度磁场分离器(HGMS)中执行步骤c)。 3.权利要求1或2的方法，其中步骤d)在高梯度磁场分离器(HGMS)中执行。 4.权利要求3的方法，其中步骤c)和d)都在相同的高梯度磁场分离器(HGMS)中执行。 5. 权利要求3的方法，其中步骤c)在洗涤器HGMS (342)中执行和步骤d)在洗脱HGMS(8;108;208;344)中执行。 6.任一项前述权利要求的方法，其中在步骤d)之后，所述磁珠在生物反应器容器中被清洗、再平衡并重复使用。 7. 任一项前述权利要求的方法，其中所述细胞培养物包含至少1 mg/ml目标生物分子或免疫球蛋白。 8. 任一项前述权利要求的方法，其中每升细胞培养物50-200 ml所述珠与所述细胞培养物接触。 9.任一项前述权利要求的方法，其还包括向所述细胞培养物添加吸附剂或沉淀剂。 10.任一项前述权利要求的方法，其中所述洗脱液被直接应用于色谱柱。 11.任一项前述权利要求的方法，其中所述洗脱液被直接应用于病毒过滤器。 12.任一项前述权利要求的方法，其中步骤c)包括以下顺序： i) 移除所述磁场； ii) 再悬浮所述珠； iii) 使所述珠与一部分洗涤液接触； iv) 用磁场保留所述珠；和 v) 从所述保留的珠除去洗涤液。 13.任一项前述权利要求的方法，其中在步骤d)中，所述珠用磁场保留。 14.任一项前述权利要求的方法，其中步骤b)在生物反应器中执行。 15.权利要求14的方法，其中所述生物反应器容器是柔性袋。 16.权利要求15的方法，其中所述柔性袋被安装在适合围绕水平轴摇动的托盘上。 17.权利要求16的方法，其中所述托盘被布置成绕轴转动至垂直的位置，用来排空所述柔性袋。 18.权利要求14-17的任一项的方法，其中步骤c)和任选步骤d)在所述生物反应器容器中执行。 19.权利要求18的方法，其中所述生物反应器容器的一部分被配置用于所述磁珠的磁性保留。 20.权利要求14-19的任一项的方法，其中所述生物反应器容器是安装在可移动托盘上的柔性袋，且所述可移动托盘包括至少一个磁铁或磁铁支架。 21.任一项前述权利要求的方法，其中所述磁珠是预灭菌的。 22.权利要求21的方法，其中所述磁珠是干燥供应的。 23.权利要求21或22的方法，其中所述磁珠通过预灭菌管和一个或多个无菌连接器从预灭菌珠容器传送到所述生物反应器容器、磁分离器或接触器。 24. 任一项前述权利要求的方法，其中在步骤d)之后，所述磁珠被再生并再循环到所述生物反应器容器中并重复步骤b) - d)。 25.权利要求24的方法，其中所述磁珠经灭菌后再循环到所述生物反应器容器中。 26.任一项前述权利要求的方法，其中细胞在所述生物反应器容器中，在所述磁珠的存在下培养。 27.权利要求1-13或21-22的任一项的方法，其中在步骤b)中，所述细胞培养物是一种未澄清或细胞-耗竭的细胞培养物。 28.权利要求27的方法，其中步骤a)包括提供多个依据权利要求63-79的任一项的磁珠。 29. 权利要求27-28的任一项的方法，其中所述未澄清或细胞-耗竭的细胞培养物包含至少1 mg/ml目标生物分子或免疫球蛋白。 30. 权利要求27-29的任一项的方法，其中每升细胞培养物50-200 ml的所述珠与所述未澄清或细胞-耗竭的细胞培养物接触。 31.权利要求27-30的任一项的方法，其还包括向所述未澄清或细胞-耗竭的细胞培养物添加吸附剂或沉淀剂。 32.权利要求26-31的任一项的方法，其中步骤b)在接触器(9;109;322)中执行。 33.权利要求32的方法，其中所述接触器是柔性袋。 34.权利要求33的方法，其中所述柔性袋(405)安装在适合围绕水平轴摇动的托盘(410)上。 35.权利要求34的方法，其中所述托盘被布置成绕轴转动至垂直的位置，用来排空所述柔性袋。 36.权利要求27-35的任一项的方法，其中步骤b)和c)都在合并的接触器和磁分离器中执行。 37.权利要求36的方法，其中所述合并的接触器和磁分离器是具有磁铁(450;430)的柔性袋(405)，所述磁铁与所述柔性袋接触或相邻。 38.权利要求37的方法，其中所述柔性袋由适合围绕水平轴摇动的托盘(410)支撑，和其中所述托盘任选地包含磁铁(430)。 39.权利要求32-38的任一项的方法，其中步骤b)、c)和d)用所述细胞培养物的等分试样重复。 40.权利要求39的方法，其中使用多个接触器或合并的接触器-磁分离器。 41.权利要求40的方法，其中步骤b)、c)和d)之一在一个接触器或接触器-磁分离器中与步骤b)、c)和d)中的另一个在另一个接触器或接触器-磁分离器中同时执行。 42.权利要求40或41的方法，其中步骤b)在第一个接触器或合并的接触器-磁分离器中执行，然后将细胞培养物传送到具有磁珠和细胞培养物的第二个接触器或合并的接触器-磁分离器中，用于捕获步骤b)中未与磁珠结合的任何目标生物分子。 43.权利要求27-42的任一项的方法，其中步骤b)在接触器(322)中执行，和其中在步骤d)之后，所述珠被再循环至所述接触器。 44.权利要求27-43的任一项的方法，其中步骤b)用来自细胞分离装置(362)的细胞-耗竭的细胞培养物执行。 45.权利要求44的方法，其中所述细胞分离装置是沉淀器。 46.权利要求44的方法，其中所述细胞分离装置是声学分离器。 47.权利要求27-46的任一项的方法，其中所述细胞培养物是灌注培养物。 48.权利要求27-47的任一项的方法，其中所述细胞培养物是恒化培养物。 49.任一项前述权利要求的方法，其中所述洗脱液被直接应用于色谱柱。 50.权利要求1-48的任一项的方法，其中所述洗脱液被直接应用于病毒过滤器。 51.任一项前述权利要求的方法，其中所述目标生物分子是免疫球蛋白。 52. 权利要求51的方法，其中所述磁珠包含多孔基质和一个或多个嵌入所述基质的磁性粒子，其中所述基质包含多孔聚合物和共价偶联于所述多孔聚合物的至少10 mg/ml Fc-结合蛋白配体。 53. 权利要求52的方法，其中所述配体对免疫球蛋白具有2000 pM或更低的亲合常数koff/kon。 54.权利要求52或53的方法，其中所述多孔聚合物是交联的。 55.权利要求52-54的任一项的方法，其中所述多孔聚合物是多糖。 56.权利要求54或55的方法，其中所述多孔聚合物是交联的琼脂糖或琼脂，或包含交联的琼脂糖或琼脂。 57.权利要求52-56的任一项的方法，其中所述磁性粒子是亚铁磁性的。 58.权利要求52-57的任一项的方法，其中所述磁性粒子包含磁铁矿或磁赤铁矿。 59. 权利要求52-58的任一项的方法，其中所述磁珠包含5-15 wt. %的所述磁性粒子。 60.权利要求52-59的任一项的方法，其中所述磁性粒子的体积-加权中值直径(d50,v)为1-5微米。 61. 权利要求52-60的任一项的方法，其中在所述磁珠中，所述磁性粒子在珠例如每个珠的中心区域的浓度为在所述珠的表面区域的浓度的至少200%，其中中心区域被定义为具有离珠表面> 0.2个珠半径的距离，和表面区域被定义为具有离珠表面< 0.2个珠半径的距离。 62. 权利要求52-61的任一项的方法，其中Mw 100 kDa的葡聚糖的Kav值，如对所述磁珠用反相尺寸排阻色谱法测定的，是0.5-0.9。 63. 权利要求52-62的任一项的方法，其中所述交联聚合物在多孔基质中的浓度为1-5wt. %，例如2-5或3-5 wt. %。 64. 权利要求52-63的任一项的方法，其中所述珠的平均密度为1.05-1.20 g/ml。 65.权利要求52-64的任一项的方法，其中所述配体包含细菌Fc-结合剂。 66. 权利要求52-65的任一项的方法，其中所述配体包含葡萄球菌蛋白A (SpA)的一个或多个Fc-结合结构域或所述结构域的一个或多个突变体。 67. 权利要求52-66的任一项的方法，其中所述配体包含SpA Fc-结合结构域的一个或多个碱稳定的突变体。 68.权利要求52-67的任一项的方法，其中所述珠的体积-加权中值直径(d50,v)为8-300微米。 69.任一项前述权利要求的方法，其在权利要求91-104的任一项的设备上执行。 70. 一种免疫球蛋白-结合磁珠(50)，其包含多孔基质(51)和一个或多个嵌入所述基质的磁性粒子(52)，其中所述基质包含多孔聚合物和共价偶联于所述多孔聚合物的至少10mg/ml Fc-结合蛋白配体。 71. 权利要求70的磁珠，其中所述配体对免疫球蛋白具有2000 pM或更低的亲合常数koff/kon。 72.权利要求70或71的珠，其中所述多孔聚合物是交联的。 73.权利要求70-72的任一项的珠，其中所述多孔聚合物是多糖。 74.权利要求70-73的任一项的珠，其中所述交联聚合物是交联的琼脂糖或琼脂。 75.权利要求70-74的任一项的珠，其中所述磁性粒子是亚铁磁性的。 76.权利要求70-75的任一项的珠，其中所述磁性粒子包含磁铁矿或磁赤铁矿。 77. 权利要求70-76的任一项的珠，其包含5-15 wt. %的所述磁性粒子。 78.权利要求70-77的任一项的珠，其中所述磁性粒子的体积-加权中值直径(d50,v)为1-5微米。 79. 权利要求70-78的任一项的珠，其中所述珠的中心区域(53)中所述粒子的浓度为所述珠的表面区域(54)中浓度的至少200%，其中中心区域被定义为具有离珠表面(55) >0.2个珠半径(r)的距离，和表面区域被定义为具有离珠表面< 0.2个珠半径的距离。 80. 权利要求70-79的任一项的珠，其中Mw 100 kDa的葡聚糖的Kav值经反相尺寸排阻色谱法测定为0.5-0.9。 81. 权利要求70-80的任一项的珠，其中多孔基质中所述交联聚合物的浓度是1-5 wt.%，例如2-5或3-5 wt. %。 82. 权利要求70-81的任一项的珠，其具有1.05-1.20 g/ml的密度。 83.依据权利要求70-82的任一项的珠，其中所述配体包含细菌Fc-结合剂。 84. 依据权利要求70-83的任一项的珠，其中所述配体包含葡萄球菌蛋白A (SpA)的一个或多个Fc-结合结构域或所述结构域的一个或多个突变体。 85. 依据权利要求70-84的任一项的珠，其中所述配体包含SpA Fc-结合结构域的一个或多个碱稳定的突变体。 86.多个依据权利要求70-85的任一项的珠，其体积-加权中值直径(d50,v)为8-300微米。 87.多个依据权利要求70-86的任一项的珠用于从细胞培养物分离免疫球蛋白的用途。 88.权利要求87的用途，其中所述细胞培养物是未澄清或细胞-耗竭的细胞培养物。 89.权利要求88的用途，其中所述分离在生物反应器中执行。 90.权利要求87的用途，其包括权利要求1-69的任一项的方法。 91.一种用于从细胞培养物分离目标生物分子，例如免疫球蛋白的分离设备(500)，所述设备包括：至少一个包含磁珠的磁分离器(505,507)；流体控制系统(501)，其被流体和信号连接到所述至少一个磁分离器，被流体连接到生物反应器(502)和至少一个缓冲剂容器(510,515,520)，并被配置成将细胞培养物从所述生物反应器传送到所述至少一个磁分离器和从所述至少一个磁分离器传送。 92.权利要求91的分离设备，其中所述至少一个磁分离器包含依据权利要求70-86的任一项的磁珠。 93.权利要求85或86的分离设备，其被配置以执行权利要求1-69的任一项的方法。 94.权利要求91-93的任一项的分离设备，其包含第一和第二磁分离器，且其中所述流体控制系统被配置为在所述第一和第二磁分离器中并行或顺序处理所述细胞培养物的等分试样。 95.权利要求91-94的任一项的分离设备，其包含第一、第二和第三磁分离器，且其中所述流体控制系统被配置为在所述第一、第二和第三磁分离器中并行或顺序处理所述细胞培养物的等分试样。 96.权利要求91-95的任一项的分离设备，其中所述至少一个磁分离器包括摇动平台(410)上的柔性袋(405)。 97.权利要求96的分离设备，其包括在所述袋(405)下的电磁铁(431)，所述电磁铁被信号连接到所述流体控制系统(501)。 98.权利要求91-97的任一项的分离设备，其中所有弄湿的组件都是单次使用组件。 99.权利要求98的分离设备，其中所述单次使用组件包括柔性袋、塑料或弹性管和任选一个或多个单次使用泵头。 100.权利要求98或99的分离设备，其中所述单次使用组件作为一个或多个预先组装的流式套件提供，其被配置为彼此无菌连接和/或与其它组件无菌连接。 101.权利要求100的分离设备，其中所述预先组装的流式套件是预灭菌的。 102.一种包含与接触器(9;109;322)流体连接的生物反应器(3;103;203;302)的设备，其中所述接触器与高梯度磁场分离器(HGMS)流体连接。 103. 权利要求102的设备，其中所述接触器与洗涤器HGMS (342)流体连接，和所述洗涤器HGMS与洗脱HGMS (8;108;208;344)流体连接。 104.权利要求102或103的设备，其中所述生物反应器通过细胞分离装置(362)与所述接触器流体连接，所述细胞分离装置被配置以将细胞-耗竭的细胞培养物递送至所述接触器。
所属类别：	发明专利