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原文传递基于紫外-可见光谱的复杂溶液中微生物含量的检测方法

专利名称：	基于紫外-可见光谱的复杂溶液中微生物含量的检测方法
摘要：	本发明提供了一种在复杂溶液中，能有效解决由于检测背景成分复杂引起的光谱中微生物特征谱峰红移、介质成分与微生物间的谱峰重叠及光谱噪声干扰等问题。本发明以牛乳作为检测背景，大肠杆菌作为检测对象，首先对大肠杆菌菌粉进行活化及分离纯化，获得大肠杆菌菌悬液；利用紫外‑可见分光光度计获取牛乳中不同浓度待测菌悬液的紫外‑可见光谱；采用标准正态变量变换消除牛乳中蛋白质、脂肪等大分子散射引起的基线漂移与光谱噪声干扰等问题；采用二维相关分析法实现牛乳与大肠杆菌重叠光谱的分离，拾取二维光谱中能表征大肠杆菌的特征波段；采用滑窗平滑法消除机械噪声干扰；基于RBF神经网络建立预测模型，实现对牛乳中大肠杆菌总数的定量检测。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	黑龙江;23
申请人：	哈尔滨理工大学
发明人：	王晓莹;周真;张浩泽
专利状态：	有效
申请日期：	2019-05-27T00:00:00+0800
发布日期：	2019-08-27T00:00:00+0800
申请号：	CN201910444260.0
公开号：	CN110174365A
分类号：	G01N21/33(2006.01);G;G01;G01N;G01N21
申请人地址：	150080 黑龙江省哈尔滨市南岗区学府路52号
主权项：	1.基于紫外-可见光谱的复杂溶液中微生物含量的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：（1）对大肠杆菌菌粉进行活化及分离纯化，配制不同浓度的大肠杆菌菌悬液，与灭菌牛乳混合，得到待测菌悬液；（2）采用紫外-可见分光光度计获取不同浓度待测菌悬液的紫外-可见光谱；（3）采用标准正态变量变换（SNV）对紫外-可见光谱进行数据预处理，解决由于待测样本内部表面散射等对光谱的影响，对光谱基线校正，使原始光谱数据标准正态化，使之更加接近真实光谱；（4）采用二维相关分析法对预处理过的光谱数据进行二维相关分析，对牛乳与大肠杆菌重叠的特征光谱进行分离，再依据Noda规则拾取二维图谱中能够表征大肠杆菌生命活性的特征波段；（5）采用滑窗平滑法（SMOOTH）对特征波段的光谱曲线进行平滑处理，以减弱机械噪声的干扰；（6）采用RBF人工神经网络建立特征吸收波段与大肠杆菌总数之间的预测模型，实现对牛乳中大肠杆菌总数的定量检测。 2.根据权利要求1所述的基于紫外-可见光谱的复杂溶液中微生物含量的检测方法，其特征在于，所述步骤（1）对大肠杆菌菌粉进行活化及分离纯化，配置待测菌悬液的步骤如下：菌粉的活化：依据菌粉活化说明，处于无菌环境下，用接种丝蘸取适量菌粉置于复溶液中，混合均匀，采用三区划线法将菌液接种到LB固体培养基中，在37℃恒温培养箱中倒置培养18h；菌粉的分离：取出活化后的培养基，挑取长势较好的生长独立的菌落于LB营养肉汤培养基中，在37℃恒温培养箱中培养18h；菌粉的纯化：将得到的菌液放入离心管中进行离心，离心机的转速设置为3000r/min，时间为5min，将离心后的上层清液吸弃，再加入去离子水摇匀，重复上述步骤三次，以上步骤得到大肠杆菌菌悬液。 3.根据权利要求1所述的基于紫外-可见光谱的复杂溶液中微生物含量的检测方法，其特征在于，所述步骤（2）利用紫外-可见分光光度计进行了光谱数据的采集，将光谱检测范围设定为200~900nm，采样间隔0.5nm，采用去离子水作为基线校正空白样和对照组，从待测菌悬液中吸取5mL于比色皿中，每个浓度的样品重复测量3次，并取其均值作为测量结果，同时，进行3次独立完整的实验，共获取原始光谱数据189组，经过对光谱的初步筛选，得到可用于进一步预处理的光谱数据共120组，每组数据包含701个波长吸光度值。 4.根据权利要求1所述的基于紫外-可见光谱的复杂溶液中微生物含量的检测方法，其特征在于，所述步骤（3）采用标准正态变量变换（SNV）可有效校正牛乳中大分子散射问题，从而确定更加准确的特征波段，解决了因牛乳成分复杂，生物大分子如脂肪、蛋白质粒径分布不均造成的光散射问题，此现象会引起基线漂移和光谱噪声干扰，从而导致光谱特征提取困难。 5.根据权利要求1所述的基于紫外-可见光谱的复杂溶液中微生物含量的检测方法，其特征在于，所述步骤（4）中大肠杆菌在牛乳中的紫外-可见吸收光谱在300~500nm波段连续出现特征波峰，且波峰强度随大肠杆菌浓度增大而增大，特征波段出现红移，其主要原因是大肠杆菌体内含有的氨基酸分子中存在苯环共轭结构，从而导致特征波峰强度增大、吸收谱带红移，因此无法根据先验信息在既定位置找到大肠杆菌在牛乳中的特征吸收峰，故需重新确定红移后的特征波段位置。 6.根据权利要求1所述的基于紫外-可见光谱的复杂溶液中微生物含量的检测方法，其特征在于，所述步骤（4）中波长为300~500nm的紫外-可见光谱数据信息采用二维相关分析法进一步的对光谱特征进行拾取与分析，对牛乳与大肠杆菌重叠的特征光谱进行分离，再根据Noda规则对二维图谱中能够表征大肠杆菌生命活性的特征波段进行拾取，考虑到光谱连续性以及生化特性，确定特征波段为300~400nm。 7.根据权利要求1所述的基于紫外-可见光谱的复杂溶液中微生物含量的检测方法，其特征在于，所述步骤（5）中波长为300~400nm的特征波段采用了滑窗平滑法进行平滑处理，去除机械噪声干扰以及由紫外-可见分光光度计钨光灯光源能量不稳为光谱曲线带来的影响。 8.根据权利要求1所述的基于紫外-可见光谱的复杂溶液中微生物含量的检测方法，其特征在于，所述步骤（6）中的RBF人工神经网络建立了特征波段与大肠杆菌总数之间的模型关系，实现对牛乳中大肠杆菌的总数准确、快速定量分析检测。
所属类别：	发明专利