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原文传递一种细胞溶酶体中次氯酸根的双光子激发荧光成像方法

专利名称：	一种细胞溶酶体中次氯酸根的双光子激发荧光成像方法
摘要：	本发明公开了一种细胞溶酶体中次氯酸根的双光子激发荧光成像方法，荧光探针1，5‑MQDA的制备方法操作步骤如下所示：将单取代或未取代的1，5‑萘二胺（56.5mg，0.357mmol）溶解在5mL无水乙醇中，快速滴加6mL的6‑（3‑吗啉‑1‑丙炔）喹啉‑2‑甲醛（100mg，0.357mmol）的无水乙醇溶液，室温搅拌1小时后，快速加入硼氢化钠（140mg），反应过夜后，旋除乙醇，得到粗产物。本发明通过采用基于1，5‑二氨基萘单元作为反应识别基团，该探针能利用双光子激发技术以荧光方法实现高选择性地检测细胞内溶酶体中次氯酸根阴离子含量，继而解决了现有检测分析方法不具有高选择性、高灵敏度、响应时间快、时间和空间分辨率高的问题。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	吉林;22
申请人：	延边大学
发明人：	金京一;王翎力;武泽;苗宇;王思宏;李熙峰;麦愉卓;郑明花
专利状态：	有效
申请日期：	2019-07-05T00:00:00+0800
发布日期：	2019-08-27T00:00:00+0800
申请号：	CN201910602818.3
公开号：	CN110174390A
代理机构：	北京共腾智慧专利代理事务所(普通合伙)
代理人：	王玉霞
分类号：	G01N21/64(2006.01);G;G01;G01N;G01N21
申请人地址：	133002 吉林省延边朝鲜族自治州延吉市公园路977号
主权项：	1.一种细胞溶酶体中次氯酸根的双光子激发荧光成像方法，其特征在于：检测次氯酸根阴离子的荧光探针1，5-MQDA具有如下结构： R是氢原子，或C1-C8的烃基（烷基、含杂原子的烃基、含芳环的烃基、含杂芳环的烃基）；荧光探针1，5-MQDA的制备路线如下所示：荧光探针1，5-MQDA的制备方法操作步骤如下所示：将单取代或未取代的1，5-萘二胺（56.5mg，0.357mmol）溶解在5mL无水乙醇中，快速滴加6mL的6-（3-吗啉-1-丙炔）喹啉-2-甲醛（100mg，0.357mmol）的无水乙醇溶液，室温搅拌1小时后，快速加入硼氢化钠（140mg），反应过夜后，旋除乙醇，得到粗产物，用正己烷和乙酸乙酯的混合物作为洗脱剂，柱层析得到目标产物（产率42%），即荧光探针1，5-MQDA；熔点：241.9-242.6℃，IR（film，cm-1）：3902.0，2922.2，2852.7，2358.9，2339.7，1622.1，1585.5，1527.6，1454.3，1431.2，1330.9，1288.5，1112.9，1004.9，860.3，873.1，760.0，731.0，1HNMR（CDCl3，300MHz，ppm）δ=2.71（t，4H）；3.60（s，2H）；3.82（t，4H）；4.16（s，2H）；4.78（s，2H）；6.10（s，1H）；6.64（d，J=8.0Hz，1H）；6.84（d，J=7.4Hz，1H）；7.23（d，J=8.4Hz，1H）；7.32（t，1H）；7.36（t，1H）；7.48（d，J=8.5Hz，1H）；7.55（d，J=8.5Hz，1H）；7.77（dd，J1=1.6Hz，J2=8.7Hz，1H）；7.93（d，J=1.6Hz，1H）；8.06（d，J=8.6Hz，1H）；8.11（d，J=8.7Hz，1H），13CNMR（CDCl3，75MHz，ppm）δ=158.99，146.91，143.46，142.73，136.25，132.49，131.09，129.13，127.09，125.64，125.27，124.39，124.30，120.95，120.40，111.02，110.01，104.80，85.35，85.27，66.93，52.51，49.63，48.15，元素分析：C27H26N4O，理论值C：76.75，H：6.20，N：13.26；实测值：C：77.04，H：6.57，N：12.51；ESI-MS：C27H26N4O，m/z：423.21（M+1）。 2.根据权利要求1所述的一种细胞溶酶体中次氯酸根的双光子激发荧光成像方法，其特征在于：所述在荧光探针1，5-MQDA的制备过程中探针1，5-MQDA与ClO-作用后，在334nm波长处激发，在430nm处产生特定的荧光发射峰，且激发和发射的狭缝宽度分别设定为3和5nm，所有的光谱测试都是在25℃下进行的。 3.根据权利要求1所述的一种细胞溶酶体中次氯酸根的双光子激发荧光成像方法，其特征在于：所述在探针1，5-MQDA对多种分析物种的选择性荧光应答过程中，当探针1，5-MQDA的浓度为10.0μM时，分析物包括：过氧化氢H2O2、单线态氧1O2、羟基自由基·OH、过氧化亚硝酰ONO2-、次氯酸钠NaOCl，它们的浓度均为100.0μM，每一种分析物加入测试体系后，经充分震荡混合后立即进行相应的荧光光谱测试，结果如图1所示，在所测试的ROS物种中，只有NaOCl能够使探针1，5-MQDA在430nm处产生强烈的荧光发射信号，而其它测试的ROS物种则不产生这个作用，且NaOCl与探针1，5-MQDA能发生专一性的作用，探针1，5-MQDA可以在水溶液体系中选择性识别NaOCl，并产生特定的荧光发射信号。 4.根据权利要求1所述的一种细胞溶酶体中次氯酸根的双光子激发荧光成像方法，其特征在于：所述荧光探针1，5-MQDA在pH=7.0的水体系过程中，将2.0μM浓度的探针1，5-MQDA为加入浓度为100.0μM的NaOCl，快速充分振荡1分钟后，立即开始计时，每间隔1分钟即时测定体系在430nm处荧光发射强度，结果如图2所示，体系在430nm处的荧光发射强度在测试开始时就已远远大于探针自身的荧光强度，接近饱和，说明探针与次氯酸钠响应时间小于1分钟。 5.根据权利要求1所述的一种细胞溶酶体中次氯酸根的双光子激发荧光成像方法，其特征在于：所述在ClO-浓度对探针1，5-MQDA（2.0μM）荧光发射强度的影响及检测限时，pH=7.0条件下，固定探针1，5-MQDA的浓度为2.0μM，分别加入浓度为0-50.0μM的NaOCl水溶液（每组NaOCl浓度以5.0μM递增），经充分震荡混合后，测定不同组的荧光光谱，参见图3，在未加入NaClO时，体系几乎没有荧光发射信号，随着溶液中NaClO浓度的增加，体系在430nm处的荧光强度不断增加。 6.根据权利要求1所述的一种细胞溶酶体中次氯酸根的双光子激发荧光成像方法，其特征在于：所述探针1，5-MQDA在细胞内溶酶体定位时过程中，Raw264.7细胞用脂多糖LPS（100μg/mL）预处理30h，更换培养基，加入市售LysoTracker（50nM）孵育10min，再加入探针1，5-MQDA（2.0μM）共同孵育20min，成像，640nm与561nm激发，收集蓝、红通道荧光，如图4所示。
所属类别：	发明专利