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原文传递一种快速检测环孢霉素的时间分辨荧光免疫层析试剂条

专利名称：	一种快速检测环孢霉素的时间分辨荧光免疫层析试剂条
摘要：	本发明提出了一种快速检测环孢霉素的时间分辨荧光免疫层析试剂条，其包括检测卡和可选择的荧光免疫定量分析仪，所述检测卡包括样品垫、结合垫、具有检测线和质控线的检测垫、吸收垫以及背衬板，所述结合垫喷涂有纳米微球时间分辨荧光‑环孢霉素探针，所述纳米微球时间分辨荧光‑环孢霉素探针由纳米荧光微球和环孢霉素单克隆抗体制备，所述检测线由环孢霉素蛋白衍生物喷涂制备，所述质控线由羊抗鼠IgG抗体喷涂制备，所述环孢霉素抗体为鼠源性抗体。本发明检测灵敏度高，检测范围广，检测稳定可靠，操作简便易行，仅需5分钟就能获得准确、可靠的测定结果，拥有良好的商业化应用前景。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	上海;31
申请人：	上海健耕医药科技股份有限公司
发明人：	刘斌虎;吴云林;傅琳
专利状态：	有效
申请日期：	2019-02-28T00:00:00+0800
发布日期：	2019-08-16T00:00:00+0800
申请号：	CN201910149920.2
公开号：	CN110133258A
代理机构：	上海启核知识产权代理有限公司
代理人：	达晓玲
分类号：	G01N33/558(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	201100 上海市闵行区陈行公路2388号2幢11楼1101室
主权项：	1.一种快速检测环孢霉素的时间分辨荧光免疫层析试剂条，其包括检测卡和可选择的荧光免疫定量分析仪，所述检测卡包括样品垫、结合垫、具有检测线和质控线的检测垫、吸收垫以及背衬板，其特征在于，所述结合垫喷涂有纳米微球时间分辨荧光-环孢霉素探针，所述纳米微球时间分辨荧光-环孢霉素探针由纳米荧光微球和环孢霉素单克隆抗体制备，所述检测线由环孢霉素蛋白衍生物喷涂制备，所述质控线由羊抗鼠IgG抗体喷涂制备，所述环孢霉素抗体为鼠源性抗体。 2.根据权利要求1所述一种快速检测环孢霉素的时间分辨荧光免疫层析试剂条，其特征在于，所述检测垫为硝酸纤维素膜且为孔径5～12μm的多孔样结构膜；所述样品垫、结合垫的材质为玻璃纤维素膜或无纺布，所述吸收垫的材质为吸水滤纸。 3.根据权利要求1或2所述一种快速检测环孢霉素的时间分辨荧光免疫层析试剂条的制备方法，其特征在于，包括以下的步骤： S1.利用羧基化聚苯乙烯纳米微球，制备纳米荧光微球；所述纳米荧光微球中，稀土元素离子、β-二酮体类螯合物和荧光增强协同剂的摩尔比为1.2∶3∶3； S2.利用步骤S1制备的纳米荧光微球和环孢霉素单克隆抗体，制备纳米微球时间分辨荧光-环孢霉素探针； S3.利用步骤S2制备的纳米微球时间分辨荧光-环孢霉素探针喷涂在玻纤膜上得到纳米荧光微球标记的环孢霉素单克隆抗体结合垫； S4.利用环孢霉素蛋白衍生物制备检测线，利用羊抗鼠IgG抗体制备质控线，喷涂、再与步骤S3得到的结合垫组装获得层析试纸条。 4.根据权利要求3所述一种快速检测环孢霉素的时间分辨荧光免疫层析试剂条的制备方法，其特征在于，所述羧基化聚苯乙烯纳米微球的直径在80nm～120nm之间，所述稀土元素离子为铕离子和/或钐离子，所述β-二酮体类螯合物为β-萘甲酰三氟丙酮，所述荧光增强协同剂为三辛基氧化膦。 5.根据权利要求3所述一种快速检测环孢霉素的时间分辨荧光免疫层析试剂条的制备方法，其特征在于，步骤S1中所述纳米荧光微球由包括以下步骤的方法制得： A.取羧基化聚苯乙烯纳米微球，加入去离子水和丙酮混合液，使得羧基化的聚苯乙烯微球的含量为1wt％，所述去离子水和所述丙酮的体积比为1:1，搅拌均匀，得反应液a； B.向反应液a中依次加入0.1mol/L三氯化铕60μL或0.1mol/L三氯化钐60μL、0.1mol/Lβ-萘甲酰三氟丙酮150μL、0.1mol/L三辛基氧化膦150μL，室温反应16小时，得到反应液b； C.将反应液b通过减压蒸馏方式将溶液中的有机溶剂去除，离心洗涤两次，将沉淀重新分散到去离子水中保存。 6.根据权利要求3所述一种快速检测环孢霉素的时间分辨荧光免疫层析试剂条的制备方法，其特征在于，步骤S2中所述纳米微球时间分辨荧光-环孢霉素探针由包括以下方法制得：将纳米荧光微球，溶于0.01mol/L pH8.0的硼酸缓冲液中，使得荧光微球含量为0.2wt％，500W超声处理30秒后，缓慢加入15mg/mL的碳二亚胺200μL，振荡反应15分钟后，6000r/min离心10分钟，收集沉淀，用0.01mol/L pH 8.0的硼酸缓冲液反复洗涤沉淀，重复离心步骤2次，得到活化的荧光微球；将活化的荧光微球复溶于5mL 0.01mol/L pH8.0的硼酸缓冲液中，加入400μg环孢霉素单克隆抗体，4℃搅拌反应4小时，再离心10分钟，收集沉淀，将沉淀复溶于含1wt％牛血清白蛋白的、0.01mol/L pH7.4的磷酸缓冲液中保存。 7.根据权利要求3所述一种快速检测环孢霉素的时间分辨荧光免疫层析试剂条的制备方法，其特征在于，步骤S3中所述结合垫裁成8mm的宽度，再使用喷金仪以5μL/cm的喷量将步骤S2中制备完成的标记复合物稀释50倍后固定于结合垫上，并置于恒温鼓风干燥箱中，37℃烘干16小时。 8.根据权利要求3所述一种快速检测环孢霉素的时间分辨荧光免疫层析试剂条的制备方法，其特征在于，步骤S4中所述层析试纸条由包括以下方法制得：将环孢霉素蛋白衍生物用含1wt％海藻糖、1wt％牛血清白蛋白、0.05wt％吐温-20的0.01mol/L pH7.4的磷酸缓冲溶解至终浓度0.1mg/mL，得喷膜液A，用喷膜机将喷膜液A喷涂在距硝酸纤维素膜左端20mm处形成检测线，所述百分比为质量体积百分比；将羊抗鼠IgG用含1％海藻糖、1wt％牛血清白蛋白、0.05wt％吐温20的0.01mol/L pH7.4的磷酸缓冲溶解至终浓度1.0mg/mL，得喷膜液B，用喷膜机将喷膜液B喷涂在距硝酸纤维素膜右端30mm处形成质控线，质控线与检测线相隔10mm；将喷涂好的硝酸纤维素膜置于25℃恒温真空干燥箱中烘干，在硬板纸上依次搭接并粘贴划有检测线和质控线的硝酸纤维素膜、滤纸、结合垫、样品垫以及吸水纸，再剪切成4mm宽的试纸条。
所属类别：	发明专利