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原文传递一种可视化的基于界面移动距离测定尿样中凝血酶的方法

专利名称：	一种可视化的基于界面移动距离测定尿样中凝血酶的方法
摘要：	本发明涉及一种可视化的基于界面移动距离测定尿样中凝血酶的方法，该方法为：在稀释后的待测尿样中加入凝血酶核酸适配体1预修饰的磁性纳米颗粒，以及凝血酶核酸适配体2预修饰的辣根过氧化物酶，共同孵育后进行显色反应，将显色反应产物进行电泳氧化还原界面滴定测试，记录待测尿样的界面迁移距离，根据待测尿样的界面迁移距离采用标准曲线法计算待测尿样中的凝血酶浓度。与现有技术相比，本发明实现了对于凝血酶快速、可视化的检测，且检测灵敏度高、不依赖昂贵检测设备，适合在条件受限地区推广使用。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	上海;31
申请人：	上海交通大学
发明人：	曹成喜;孔昊;樊柳荫;刘伟文
专利状态：	有效
申请日期：	2019-06-11T00:00:00+0800
发布日期：	2019-09-10T00:00:00+0800
申请号：	CN201910502100.7
公开号：	CN110220893A
代理机构：	上海科盛知识产权代理有限公司
代理人：	顾艳哲
分类号：	G01N21/78(2006.01);G;G01;G01N;G01N21
申请人地址：	200030 上海市徐汇区华山路1954号
主权项：	1.一种可视化的基于界面移动距离测定尿样中凝血酶的方法，其特征在于，该方法为：在稀释后的待测尿样中加入凝血酶核酸适配体1预修饰的磁性纳米颗粒，以及凝血酶核酸适配体2预修饰的辣根过氧化物酶，共同孵育后进行显色反应，将显色反应产物进行电泳氧化还原界面滴定测试，记录待测尿样的界面迁移距离，根据待测尿样的界面迁移距离计算待测尿样中的凝血酶浓度。 2.根据权利要求1所述的一种可视化的基于界面移动距离测定尿样中凝血酶的方法，其特征在于，所述待测尿样的稀释具体为：将采集的新鲜尿样用Tris-HCl缓冲溶液稀释100倍，所用的Tris-HCl缓冲液其pH在7.0-8.0之间。 3.根据权利要求1所述的一种可视化的基于界面移动距离测定尿样中凝血酶的方法，其特征在于，所述磁性纳米颗粒选用表面修饰有链霉亲和素的磁性纳米颗粒。 4.根据权利要求3所述的一种可视化的基于界面移动距离测定尿样中凝血酶的方法，其特征在于，所述磁性纳米颗粒采用以下步骤进行预修饰： (1)在含有Triton X-100的Tris-HCl缓冲溶液中加入链霉亲和素修饰的磁性纳米颗粒和凝血酶核酸适配体1，一次孵育20-40分钟；磁性纳米颗粒在Tris-HCl缓冲溶液中的添加量为0.2-0.4mg/mL，凝血酶核酸适配体1在Tris-HCl缓冲溶液中的添加量为0.5-2.5nmol/mL； (2)将一次孵育完成的磁性纳米颗粒用含Triton X-100的Tris-HCl缓冲溶液洗涤，将洗涤过的纳米颗粒重新分散于含有Triton X-100、2％BSA和0.2g/L D-生物素的Tris-HCl缓冲溶液中二次孵育20-40分钟； (3)将二次孵育完成的磁性纳米颗粒用Tris-HCl缓冲溶液洗涤，将洗涤后的磁性纳米颗粒分散于Tris-HCl缓冲溶液中，得到凝血酶核酸适配体1预修饰的磁性纳米颗粒悬浮液。 5.根据权利要求1所述的一种可视化的基于界面移动距离测定尿样中凝血酶的方法，其特征在于，所述辣根过氧化物酶采用以下步骤进行预修饰：在含有2％BSA的Tris-HCl缓冲溶液中加入链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶与凝血酶核酸适配体2，混合孵育20-40分钟，得到凝血酶核酸适配体2预修饰的辣根过氧化物酶溶液，链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶在Tris-HCl缓冲溶液中的添加量为0.03-0.06nmol/mL，凝血酶核酸适配体2在Tris-HCl缓冲溶液中的添加量为链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶添加量的3-4倍。 6.根据权利要求1所述的一种可视化的基于界面移动距离测定尿样中凝血酶的方法，其特征在于，所述共同孵育具体为：将稀释后的待测尿样、凝血酶核酸适配体1预修饰的磁性纳米颗粒、凝血酶核酸适配体2预修饰的辣根过氧化物酶和含有2％BSA的Tris-HCl缓冲溶液混合，孵育10-20分钟，凝血酶核酸适配体1与凝血酶核酸适配体2分别识别凝血酶分子表面两侧的纤维蛋白原结合位点以及肝素结合位点，与凝血酶分子结合形成磁性纳米颗粒-凝血酶-辣根过氧化物酶复合物，并用含有Tween-20的Tris-HCl缓冲溶液洗涤，其中，稀释后的待测尿样、凝血酶核酸适配体1预修饰的磁性纳米颗粒、凝血酶核酸适配体2预修饰的辣根过氧化物酶和含有2％BSA的Tris-HCl缓冲溶液的体积比例为2：1：1：6。 7.根据权利要求6所述的一种可视化的基于界面移动距离测定尿样中凝血酶的方法，其特征在于，将TMB显色液与孵育完毕生成的磁性纳米颗粒-凝血酶-辣根过氧化物酶复合物混合，显色5-15分钟，显色反应完成后，将磁性纳米颗粒-凝血酶-辣根过氧化物酶复合物借助磁力从显色产物中分离，并将显色产物进行电泳滴定检测，形成肉眼可见的氧化还原反应界面，并在电泳滴定通道中迁移，氧化还原反应界面在滴定通道中迁移距离Dt与样品中凝血酶浓度CTM之间存在如下关系： Dt＝aCTM/(CTM+b)，式中，a与b是两个与实验条件相关的常数。 8.根据权利要求1所述的一种可视化的基于界面移动距离测定尿样中凝血酶的方法，其特征在于，所述电泳氧化还原界面滴定测试具体包括以下步骤： (1)加热琼脂糖凝胶混合物至完全溶解，取一部分溶解后的凝胶溶液注入滴定芯片的桥接通道中，剩余部分的凝胶溶液降温至60℃后加入L-抗坏血酸混合均匀，一并注入滴定芯片的滴定通道中； (2)待凝胶溶液凝固后，将显色反应得到的显色液加入到滴定测试设备的样品池中，将含有NaOH的阳极电极液加入到阳极池中，含有HCl和L-抗坏血酸的阴极电极液加入到阴极池中，在阳极池与阴极池之间施加恒定电场，进行滴定测试； (3)滴定几分钟后，读取记录待测尿样的界面位移距离。 9.根据权利要求8所述的一种可视化的基于界面移动距离测定尿样中凝血酶的方法，其特征在于，所述琼脂糖凝胶混合物包含质量体积分数为1％的琼脂糖凝胶和KCl的电解质溶液。 10.根据权利要求1所述的一种可视化的基于界面移动距离测定尿样中凝血酶的方法，其特征在于，根据待测尿样的界面迁移距离，采用标准曲线法计算待测尿样中的凝血酶浓度，具体通过以下方法构建：配制多组凝血酶标准溶液，在凝血酶标准溶液中分别加入与待测尿样等量的凝血酶核酸适配体1预修饰的磁性纳米颗粒以及凝血酶核酸适配体2预修饰的辣根过氧化物酶，共同孵育后进行显色反应，将显色反应产物进行电泳氧化还原界面滴定测试，记录标准溶液的界面迁移距离，得到凝血酶浓度的标准曲线。
所属类别：	发明专利