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原文传递一种尿液外泌体ELISA的检测方法及其应用

专利名称：	一种尿液外泌体ELISA的检测方法及其应用
摘要：	本发明公开了一种外泌体检测的ELISA方法，还提供一种检测尿液外泌体的ELISA检测方法在阿尔茨海默病的评估和防治方面的应用。本方法具有可靠、快速、经济地无创检测外泌体的特点，本发明的检测方法也不需要昂贵且精密的实验仪器，具有很大的应用前景。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	上海;31
申请人：	上海惠皓医疗科技有限公司
发明人：	江海松;张杰文;富磊;孙瑞华
专利状态：	有效
申请日期：	2019-06-21T00:00:00+0800
发布日期：	2019-08-30T00:00:00+0800
申请号：	CN201910541257.0
公开号：	CN110187101A
代理机构：	上海海贝律师事务所
代理人：	范海燕
分类号：	G01N33/558(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	200241 上海市闵行区东川路555号丙楼1168室
主权项：	1.一种尿液外泌体ELISA的检测方法，其特征在于，包括如下具体步骤： (1)收集健康志愿者/阿尔茨海默病患者尿液样本，并将其存放于超低温冰箱里，保存备用； (2)从超低温冰箱里取出健康志愿者/阿尔茨海默病患者尿液样本，在2-6℃条件下解冻，然后将尿液样本分别转移到试管中，离心，去除细胞和细胞碎片，将上清液分别转移到无菌试管中； (3)在步骤(2)的上清液中各加入经Exo Quick提取的外泌体沉淀，通过反转或轻弹试管使其混合均匀，在低温冰箱中冷藏过夜，离心，吸取上清液，再次离心，去除所有的上清液，注意吸取上清液的过程中不要触碰到试管底部的白色外泌体沉淀； (4)在步骤(3)的白色外泌体沉淀中加入蛋白裂解液和蛋白抑制剂，涡旋，将沉淀重悬于溶液中，将溶液置于超低温冰箱里放置5min，然后置于25℃水浴锅中5min，如此重复数次，将溶液存放于超低温冰箱里，在需要的时候拿出来溶化； (5)从在室温条件下平衡后的铝箔袋中取出所需板条，在板条上设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品，样本孔中加入待测样本，标准品孔和样本孔中分别加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体，用封板膜封住标准品孔和样本孔，置于水浴锅或恒温箱中温育一定时间后，弃去液体，吸水纸上拍干，在标准品孔和样本孔中加满洗涤液，静置，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗涤板条数次； (6)在步骤(5)中的标准品孔和样本孔中分别加入健康志愿者尿液来源的外泌体、阿尔茨海默病患者尿液来源的外泌体，避光孵育一定时间后，在标准品孔和样本孔中均加入终止液，15min内在450nm波长处测定各孔的OD值，对尿液来源的神经元外泌体中的3种蛋白质进行检测，包括Aβ42、P-S396-Tau、Aβ1-42，除了所用的检测试剂不同，检测步骤均相同。 2.根据权利要求1所述的一种尿液外泌体ELISA的检测方法，其特征在于，所述超低温冰箱的温度为-80℃，所述低温冰箱的温度为-4℃。 3.根据权利要求1所述的一种尿液外泌体ELISA的检测方法，其特征在于，步骤(2)中离心力为3000×g，离心时间为15minutes。 4.根据权利要求1所述的一种尿液外泌体ELISA的检测方法，其特征在于，步骤(3)中第一次离心的离心力为1500×g，离心时间为30minutes；第二次离心的离心力为1500×g，离心时间为5minutes。 5.根据权利要求1所述的一种尿液外泌体ELISA的检测方法，其特征在于，步骤(4)中涡旋时间为15s。 6.根据权利要求1所述的一种尿液外泌体ELISA的检测方法，其特征在于，步骤(4)中重复3个循环。 7.根据权利要求1所述的一种尿液外泌体ELISA的检测方法，其特征在于，步骤(5)中在37℃水浴锅或恒温箱中温育60minutes。 8.根据权利要求1所述的一种尿液外泌体ELISA的检测方法，其特征在于，步骤(5)中重复洗涤板条5次。 9.根据权利要求1所述的一种尿液外泌体ELISA的检测方法，其特征在于，步骤(6)中孵育温度为37℃，孵育时间为15minutes。 10.一种检测尿液外泌体的ELISA检测方法在阿尔茨海默病的评估和防治方面的应用。
所属类别：	发明专利