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原文传递一种同位素稀释质谱法测定血清miR-224含量的方法

专利名称：	一种同位素稀释质谱法测定血清miR-224含量的方法
摘要：	本发明公开了一种同位素稀释质谱法测定血清miR‑224含量的方法，包括如下步骤：(1)合成miR‑224核酸单链并配成溶液，建立标准曲线；(2)合成核酸肽探针并配成溶液，用以捕获miR‑224；(3)合成同位素标记的多肽并配成溶液作为内标；(4)在血清样本中提取miRNA；(5)将提取出的miRNA生物素化；(6)将上述miRNA与链霉素琼脂糖球反应，形成miRNA‑生物素‑链霉亲和素琼脂糖球复合物；(7)加入核酸肽探针捕获miR‑224‑生物素‑链霉亲和素琼脂糖球复合物；(8)将上述复合物清洗干净后加入胰蛋白酶酶解，然后将酶解产物固相萃取，将萃取出的多肽吹干并复溶；(9)将复溶后的多肽和同位素标记的多肽样品进行质谱分析；(10)计算血清样本中miR‑224含量。本发明准确度高，结果可靠。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	江苏;32
申请人：	南通大学附属医院
发明人：	王峰;季伙燕;吴安琪;李袆;鞠少卿;王建新;沈蕾
专利状态：	有效
申请日期：	2019-07-04T00:00:00+0800
发布日期：	2019-09-10T00:00:00+0800
申请号：	CN201910599052.8
公开号：	CN110220994A
代理机构：	南通毅帆知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：	任毅
分类号：	G01N30/02(2006.01);G;G01;G01N;G01N30
申请人地址：	226001 江苏省南通市崇川区西寺路20号
主权项：	1.一种同位素稀释质谱法测定miR-224含量的方法，包括如下步骤： (1)将合成的miR-224核酸单链配成溶液，用于建立标准曲线； (2)合成核酸肽探针配成溶液，用以捕获miR-224； (3)将合成的同位素标记多肽并配成溶液作为内标； (4)在血清样本中提取miRNA； (5)将提取出来的miRNA进行生物素化； (6)将上述生物素化的miRNA-224与链霉素琼脂糖球反应，形成miRNA-224-生物素-链霉亲和素琼脂糖球复合物； (7)加入核酸肽探针捕获miR-224-生物素-链霉亲和素琼脂糖球复合物； (8)将核酸肽探针-miR-224-生物素-链霉亲和素琼脂糖球复合物清洗干净后加入胰蛋白酶进行酶解，然后将酶解产物进行固相萃取，将萃取出的多肽吹干并复溶； (9)将复溶后的多肽和同位素标记的多肽样品进行质谱分析； (10)计算血清样品中miR-224含量。 2.根据权利要求书1所述的同位素稀释质谱法测定miR-224含量的方法，其特征在于，所述步骤(1)具体包括如下步骤：miR-224核酸单链合成量为4OD值，每管1OD值分装，在每管中准确加入250μL DEPC水，配制成浓度为20μmol/L的miR-224溶液并分装至1.5mL离心管中，每管分装50μL，然后在各管中加入950μL超纯水稀释至浓度为1μmol/L作为贮存液并分装至1.5mL离心管中，每管分装20μL，并将分装好的核酸肽探针溶液置于-70℃冰箱保存；使用前，在miR-224贮存液中加入DEPC水稀释成系列浓度用于建立标准曲线。 3.根据权利要求书1所述的同位素稀释质谱法测定miR-224含量的方法，其特征在于，所述步骤(2)具体包括如下步骤：核酸肽探针序列为5’-CTAAACGGAACCACTAGTGACTTGA-3’-PEG2-GDRALFVGEPNR，其中5’-CTAAACGGAACCACTAGTGACTTGA-3’为探针核酸部分，与miR-224序列5’-UCAAGUCACUAGUGGUUCCGUUUAG-3’互补配对；GDRALFVGEPNR为探针肽部分，其特征是非人类任何蛋白胰酶水解后的特异性肽段，包含胰酶水解位点精氨酸R；PEG2连接核酸与肽；核酸肽探针合成量为20nmol，准确加入1mL超纯水，配制成浓度为20μmol/L的核酸肽探针溶液，每管分装100μL，然后在各管中加入900μL超纯水稀释至浓度为2μmol/L作为贮存液并分装至1.5mL离心管中，每管分装50μL，并将分装好的核酸肽探针溶液置于-70℃冰箱保存；使用前，在核酸肽探针贮存液中加入1950μL超纯水稀释至0.05μmol/L，得到核酸肽探针工作液，现用现配。 4.根据权利要求书1所述的同位素稀释质谱法测定miR-224含量的方法，其特征在于，所述步骤(3)具体包括如下步骤：将合成的1mg同位素标记的多肽GDRA[13C615N]LFVGEPNR首先用300μL乙腈超声溶解，然后加入700μL超纯水配制成浓度约为1mg/mL的同位素标记多肽贮存液并分装至1.5mL离心管中，每管分装100μL，然后在各管中加入900μL超纯水稀释至约为0.1mg/mL并分装至并1.5mL离心管中，每管分装10μL，并将分装好的核酸肽探针溶液置于-70℃冰箱保存；使用前，在浓度约为0.1mg/mL的同位素标记多肽溶液中加入990μL超纯水稀释至约为1mg/L，得到作为内标的同位素标记多肽工作液，现用现配，在定量中作为内标。 5.根据权利要求书1所述的同位素稀释质谱法测定miR-224含量的方法，其特征在于，所述步骤(4)为使用miRNA快速提取试剂盒提取血清样本中miR-224，具体包括如下步骤： ①用加样枪吸取0.25mL血清并加入0.75mL裂解液MRL，用加样枪吹打液体样品几次以帮助裂解样品中残余细胞； ②将上述样品剧烈震荡混匀，并在15-30℃条件下孵育5分钟以使核蛋白体完全分解； ③加入0.15mL氯仿，盖紧样品管盖，剧烈振荡15秒并将其在室温下孵育3分钟；④于4℃12,000rpm离心10分钟，样品会分成三层：下层有机相，中间层和上层无色的水相，RNA存在于水相中；水相层的容量大约为所加MRL体积的60％，把水相转移到新管中，进行下一步操作； ⑤加入0.6倍体积70％乙醇，颠倒混匀，并将得到的溶液和可能沉淀一起转入吸附柱RA中,其中，吸附柱套在收集管内； ⑥10,000rpm离心45秒，收集下滤液，准确估计下滤液的体积，加入2/3倍体积的无水乙醇，颠倒几次混匀，将混合液倒入到吸附柱RB中，10,000rpm离心30秒弃掉废液； ⑦加入700μL漂洗液RW，12,000rpm离心60秒，弃掉废液； ⑧加入500μL漂洗液RW，12,000rpm离心60秒，弃掉废液； ⑨将吸附柱RB放回空收集管中，12,000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应； ⑩取出吸附柱RB，放入一个RNase free离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加30-80μL RNase free water，室温放置2分钟，12,000rpm离心1分钟，收集得到纯净miRNA保存于-20℃或者更低备用。 6.根据权利要求书1所述的同位素稀释质谱法测定miR-224含量的方法，其特征在于，所述步骤(5)为使用PierceTM RNA3’End Biotinylation Kit试剂盒对血清样品中提取出的miR-224进行生物素化，具体包括如下步骤： ①除30％PEG和DMSO外，在冰上溶解试剂盒中其他所有成分，室温溶解DMSO，将30％PEG在37℃孵育5-10min，直到变为液体； ②调节加热器到85℃，转移5μL Non-labeled RNA control和血清miRNA到微量离心管中；在85℃加热3-5min，然后立即放在冰上； ③进行标记反应： ④加70μL核酸free水； ⑤加100μL氯仿提取RNA连接酶；漩涡一下，在微量离心管中高速离心2-3min使各相分离；仔细吸取上面的水相并转移到核酸-free的管子中； ⑥加10μL5M NaCl，1μL糖原和300μL冰冷的100％乙醇，在-20℃沉淀大于1h； ⑦大于13000g4℃离心15min，仔细移出上清，不要碰到沉淀物； ⑧用300μL冰冷的70％乙醇洗沉淀物，仔细移除酒精，晾干沉淀物； ⑨用冰冷的70％乙醇洗沉淀物，仔细移除酒精，晾干沉淀物； ⑩用20μL核酸free水重悬沉淀物即得生物素化miRNA，其中包含miR-224。 7.根据权利要求书1所述的同位素稀释质谱法测定miR-224含量的方法，其特征在于，所述步骤(6)具体包括如下步骤：链霉素琼脂糖球首先与tRNA和BSA反应，然后将步骤(5)的20μL生物素化miRNA与20μL经处理过的链霉素琼脂糖球反应，置于37℃摇匀2h，形成miRNA-生物素-链霉亲和素琼脂糖球复合物，其中包含miR-224-生物素-链霉亲和素琼脂糖球复合物。 8.根据权利要求书1所述的同位素稀释质谱法测定miR-224含量的方法，其特征在于，所述步骤(7)具体包括如下步骤：在步骤(6)所得miRNA-生物素-链霉亲和素琼脂糖球复合物中加入100μL0.05μmol/L核酸肽探针溶液和25μL缓冲液，置于杂交仪中杂交，65℃16h，以捕获miR-224-生物素-链霉亲和素琼脂糖球复合物，形成核酸肽探针-miR-224-生物素-链霉亲和素琼脂糖球复合物；然后用PBS清洗复合物并离心，去除上清，反复多次，将未结合的核酸肽探针去除，获得纯净核酸肽探针-miR-224-生物素-链霉亲和素琼脂糖球复合物；其中，所述缓冲液为10mM Tris，100mM KCl，1mM MgCl2，pH7.4。 9.根据权利要求书1所述的同位素稀释质谱法测定miR-224含量的方法，其特征在于，所述步骤(8)具体包括如下步骤： ①用1mL超纯水重新溶解上述核酸肽探针-miR-224-生物素-链霉亲和素琼脂糖球复合物； ②加入10μL1mg/L同位素标记多肽溶液； ③加入10μL0.04μg/μL胰酶，置于37℃酶解4h； ④将酶解产物用60mg,3mL MAX cartridges固相萃取柱进行纯化富集ALFVGEPNR和A[13C615N]LFVGEPNR；MAX cartridges固相萃取柱首先用3mL甲醇和3mL超纯水分别活化和平衡柱子，然后加入酶解产物，再用2mL超纯水清洗柱子，最后用1mL含0.2％甲酸的乙腈溶液萃取ALFVGEPNR和A[13C615N]LFVGEPNR； ⑤将上述萃取物用氮气吹干； ⑥吹干后加入250μL0.1％甲酸水溶液复溶ALFVGEPNR和A[13C615N]LFVGEPNR多肽混合物。 10.根据权利要求书1所述的同位素稀释质谱法测定miR-224含量的方法，其特征在于，所述步骤(9)具体包括如下步骤：采用岛津Nexera X2高效液相色谱系统和AB Sciex 5500三重四级杆液质联用仪，使用60mg,3mL的Symmetry ShieldTM RP18色谱柱在40℃条件下进行色谱分离；流动相为：A：含0.1％甲酸的水溶液；B：含0.1％甲酸的乙腈溶液；流速为0.2mL/min；进样量10μL；按照如下的梯度进行洗脱：B5％，0-0.1min→B35％，0.1-6min→B80％，6-6.1min→B80％，6.1-8min→B5％，8-8.1min→B5％，8.1-12min；选用正离子多反应监测模式，监测ALFVGEPNR和A[13C615N]LFVGEPNR两条多肽的信号强度；质谱系统的离子源为电喷雾电离源，喷雾电压5500 V；雾化压力55psi；雾化温度550℃；雾化气流10L/min；Q1和Q3质量选择器均设定在单位质量分辨率；用于定量分析的离子分别为m/z 501.0→571.5和m/z 505.5→572.2；碰撞能量CE分别为25eV和23eV；去簇电压DP为130V；所有数据均通过AB Sciex MultiQuant工作站软件采集和处理；所述步骤(10)具体包括如下步骤： ①建立标准曲线，用DEPC水将浓度为1μmol/L的miR-224贮存液稀释成以下系列浓度：1000nmol/L、800nmol/L、500nmol/L、300nmol/L、200nmol/L、100nmol/L、80nmol/L、60nmol/L、40nmol/L、20nmol/L、10nmol/L和5nmol/L，然后按步骤(5)～(9)具体步骤进行操作，采用岛津Nexera X2高效液相色谱和AB Sciex 5500三重四级杆液质联用仪对萃取多肽产物ALFVGEPNR和同位素标记多肽A[13C615N]LFVGEPNR的峰面积进行测定，以miR-224浓度为横坐标(x)、上述两条多肽峰面积比(y)为纵坐标建立标准曲线，曲线方程为y＝0.0103x+0.2147，R2＝0.995； ②收集血清样本，按步骤(4)～(9)具体步骤进行操作，采用岛津Nexera X2高效液相色谱和AB Sciex 5500三重四级杆液质联用仪对萃取多肽产ALFVGEPNR和同位素标记多肽A[13C615N]LFVGEPNR的峰面积进行测定，将二者峰面积比代入上述曲线方程，即可计算得血清样品中miR-224含量。
所属类别：	发明专利