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原文传递一种基于吖啶酯化学发光、链霉亲和素磁珠-生物素放大反应体系及检测试剂盒

专利名称：	一种基于吖啶酯化学发光、链霉亲和素磁珠-生物素放大反应体系及检测试剂盒
摘要：	本发明提供一种基于吖啶酯化学发光、链霉亲和素磁珠‑生物素放大反应体系的检测试剂盒，同时还提供了该试剂盒的制备工艺及检测方法，属于体外诊断技术领域。该试剂盒的反应体系包括：吖啶酯标记的抗体或抗原、生物素标记的抗体或抗原、链霉亲和素包被带有羧基或者Tosyl官能团的磁珠，所述的磁珠粒径范围为0.1‑5μm。本发明通过采用不同粒径的磁珠共混或者添加链霉亲和素的方法以及将生物素标记物与链霉亲和素磁珠预混三种方案解决了免疫试剂生物素干扰的问题。本发明的试剂盒检测线性范围宽，线性拟合度〉0.99，特异性好，灵敏度高，检测浓度低，抗生物素干扰能力高达100ng/mL以上。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	吉林;22
申请人：	迪瑞医疗科技股份有限公司
发明人：	孟令敏;阚洪晶;孙成艳;高威;何浩会
专利状态：	有效
申请日期：	2019-05-28T00:00:00+0800
发布日期：	2019-08-20T00:00:00+0800
申请号：	CN201910449405.6
公开号：	CN110146692A
代理机构：	长春众邦菁华知识产权代理有限公司
代理人：	李外
分类号：	G01N33/53(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	130000 吉林省长春市高新区宜居路3333号
主权项：	1.一种基于吖啶酯化学发光、链霉亲和素磁珠-生物素放大反应体系，其特征在于，包括：吖啶酯标记的抗体或抗原、生物素标记的抗体或抗原、链霉亲和素包被带有羧基或者Tosyl官能团的磁珠；所述的磁珠粒径为0.1-5μm。 2.根据权利要求1所述的一种基于吖啶酯化学发光、链霉亲和素-生物素放大反应体系，其特征在于，所述的吖啶酯标记的抗体或抗原的制备方法，包括： (1)配备吖啶酯母液取待标记的抗体或者抗原，标记前使用pH7.4 25mM的磷酸缓冲液替换抗体或者抗原自带的缓冲液，吖啶酯标记前先在无水N，N-二甲基甲酰胺中溶解成0.1～100mg/mL的吖啶酯母液； (2)吖啶酯标记在避光条件下，取置换完缓冲液的抗体或者抗原和吖啶酯母液按照摩尔浓度1:(1-200)的比例进行标记，标记缓冲液为pH7.4 25mM的PB，在避光条件下悬混标记1-12小时，反应结束后纯化，得到吖啶酯标记的抗体或抗原；所述的吖啶酯为N-羟基丁二酰亚胺-吖啶酯，结构式如式1所示：式1中，R1：R2和R3独立地选自:H或中的一种，n＝1-12； R4：m＝1-12；R5： 3.根据权利要求1所述的一种基于吖啶酯化学发光、链霉亲和素磁珠-生物素放大反应体系，其特征在于，所述的生物素标记的抗体或抗原的制备方法，包括： (1)配制生物素母液取待标记的抗体或者抗原，标记前使用pH7.4 25mM的磷酸缓冲液替换掉抗体或者抗原自带的缓冲液，生物素标记前先在无水N，N-二甲基甲酰胺中溶解成0.1～100mg/mL的生物素母液； (2)生物素标记在避光条件下，取置换完缓冲液的抗体或者抗原和生物素母液按照摩尔浓度1:(1-200)的比例进行标记，标记缓冲液为pH7.4 25mM PB，在避光条件下悬混标记1-12小时，反应结束后纯化，得到生物素标记的抗体或抗原；所述生物素的结构式如式2或者式3所示：其中，n＝1-13； 4.根据权利要求1所述的一种基于吖啶酯化学发光、链霉亲和素磁珠-生物素放大反应体系，其特征在于，所述的链霉亲和素包被带有羧基或者Tosyl官能团的磁珠的制备方法，包括：当磁珠为羧基磁珠时，该制备方法为：将链霉亲和素溶解于2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液中，配成浓度1-10mg/mL的缓冲液，2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液pH值范围为5.5～6.7；取羧基磁珠，使用2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液清洗，然后加入1-3-(二甲氨基-丙基)-3-乙基碳二甲氨基盐酸盐(EDC HCl)活化缓冲液活化，EDC HCl用量为磁珠质量的1％～100％，活化反应时间为5-60min，活化完成后移走上清液，加入链霉亲和素溶液，链霉亲和素用量为磁珠用量的0.1％～10％，磁珠在包被反应液中的浓度为1-50mg/mL，包被反应时间为1～24h，包被反应在室温条件下进行；当磁珠为Tosyl官能团磁珠时，制备方法包括：将链霉亲和素溶解于磷酸盐缓冲液中，配成浓度1-10mg/mL的缓冲液，磷酸盐缓冲液pH值范围为7.0～8.0；取Tosyl官能团的磁珠，使用磷酸盐缓冲液清洗，然后加入磷酸盐缓冲液重悬，再加入链霉亲和素溶液和硫酸铵，在37℃条件下使用混匀器摇匀包被4-48h，磁珠在包被反应液中的浓度范围为1-50mg/mL，链霉亲和素用量为磁珠质量的0.1％～10％，硫酸铵的反应浓度范围为0.1～2.5mol/L。 5.基于权利要求1所述的反应体系的检测试剂盒，其特征在于，命名为试剂盒A，该试剂盒A包括：磁颗粒反应液Ra1、吖啶酯标记物反应液Ra2和生物素标记物反应液Ra3；所述的磁颗粒反应液Ra1包括链霉亲和素磁珠1、链霉亲和素磁珠2、第一表面活性剂、氯化钠、第一缓冲液、第一防腐剂和第一蛋白稳定剂；或者包括：链霉亲和素磁珠1、第一表面活性剂、氯化钠、链霉亲和素、第一缓冲液、第一防腐剂和第一蛋白稳定剂；所述的链霉亲和素磁珠1的粒径为2.5～5μm，链霉亲和素磁珠2的粒径为0.1～2μm；所述的吖啶酯标记物反应液Ra2包含吖啶酯标记的抗体或抗原、氯化钠、第二缓冲液、第二防腐剂、第二表面活性剂和第二蛋白稳定剂；所述的生物素标记物反应液Ra3包含生物素标记的抗体或抗原、氯化钠、第三缓冲液、第三防腐剂、第三表面活性剂和第三蛋白稳定剂。 6.基于权利要求1所述的反应体系的检测试剂盒，其特征在于，命名为试剂盒B，该试剂盒B包括：磁颗粒反应液Rb1、吖啶酯标记物反应液Rb2和项目稀释液Rb3；所述的磁颗粒反应液Rb1包含生物素标记的抗体或抗原与链霉亲和素磁珠的混合物、氯化钠、第一表面活性剂、第一缓冲液、第一防腐剂和第一蛋白稳定剂；所述的生物素标记的抗体或抗原与链霉亲和素磁珠的混合物中链霉亲和素磁珠的粒径为1～5μm；所述的吖啶酯标记物反应液Rb2包含吖啶酯标记的抗体或抗原、氯化钠、第二缓冲液、第二防腐剂、第二表面活性剂和第二蛋白稳定剂；所述的项目稀释液Rb3包含氯化钠、第三缓冲液、第三防腐剂、第三表面活性剂和第三蛋白稳定剂。 7.根据权利要求5或6所述的检测试剂盒，其特征在于，试剂盒A、B所述的第一缓冲液、第二缓冲液和第三缓冲液独立的选自2-(N-吗啡啉)乙磺酸、哌嗪-NN-双(2-乙磺酸)、3-(N-码啡基)-2-羟基丙磺酸钠、Tris-盐酸或二(2-羟乙基)亚胺基三(羟甲基)甲烷，缓冲范围为pH5.0-8.5，浓度为10-600mmoL/L。 8.根据权利要求5或6所述的检测试剂盒，其特征在于，试剂盒A、B所述的第一防腐剂、第二防腐剂和第三防腐剂独立的选自NaN3、Proclin 300或Proclin 950，质量浓度为0.01％-1％。 9.根据权利要求5或6所述的检测试剂盒，其特征在于，试剂盒A、B所述的第一表面活性剂、第二表面活性剂和第三表面活性剂独立的选自吐温、聚乙二醇、泊洛沙姆、曲拉通和氯化胆碱，质量浓度为0.01％-5％。 10.根据权利要求5或6所述的检测试剂盒，其特征在于，试剂盒A、B所述的第一蛋白稳定剂、第二蛋白稳定剂和第三蛋白稳定剂独立的选自牛血清白蛋白、酪蛋白、牛血清Gamma球蛋白、卵蛋白、鱼蛋白中的一种或几种，质量浓度为0.1％-10％。 11.根据权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于，所述的生物素标记的抗体或抗原与链霉亲和素磁珠的混合物的制备方法，包括：取链霉亲和素磁珠，使用PB pH7.4的缓冲液清洗，然后加入生物素标记的抗体或抗原，在37℃条件下预混5min.-18h，磁珠反应浓度范围为1-50mg/mL，预混反应液为磁珠保存液。
所属类别：	发明专利