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原文传递基于基因变异分析检测直肠癌细胞药物敏感性的试剂盒

专利名称：	基于基因变异分析检测直肠癌细胞药物敏感性的试剂盒
摘要：	本发明公开了一种基于基因变异分析检测直肠癌细胞药物敏感性的试剂盒，由以下物质组成：(1)直肠癌细胞药物试剂；(2)含有通过绿色荧光蛋白标记野生P53蛋白抗体进行表面修饰的磁性纳米颗粒指示液A；(3)含有通过红色荧光蛋白标记抗变异P53蛋白抗体进行表面修饰的磁性纳米颗粒指示液B；(4)底物培养基和稀释缓冲液。本发明以野生型P53基因蛋白和变异型P53基因蛋白的表达量同时进行计算衡量患者对药物的敏感性，个体化更突出且检测结果更加精准，为该病的治疗筛选出比较敏感的药物，选择出最优化疗方案。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	贵州;52
申请人：	贵州医科大学附属医院
发明人：	章俊;高婷;李珀
专利状态：	有效
申请日期：	2019-05-18T00:00:00+0800
发布日期：	2019-09-03T00:00:00+0800
申请号：	CN201910415557.4
公开号：	CN110196327A
代理机构：	北京栈桥知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：	刘亚娟
分类号：	G01N33/574(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	550004 贵州省贵阳市云岩区贵医街28号
主权项：	1.一种基于基因变异分析检测直肠癌细胞药物敏感性的试剂盒，其特征在于，由以下物质组成： (1)直肠癌细胞药物试剂； (2)含有通过绿色荧光蛋白标记野生P53蛋白抗体进行表面修饰的磁性纳米颗粒指示液A； (3)含有通过红色荧光蛋白标记抗变异P53蛋白抗体进行表面修饰的磁性纳米颗粒指示液B； (4)底物培养基和稀释缓冲液。 2.如权利要求1所述的一种基于基因变异分析检测直肠癌细胞药物敏感性的试剂盒，其特征在于，所述直肠癌细胞药物试剂为含有质量分数为20％直肠癌细胞药物的注射剂。 3.如权利要求1所述的一种基于基因变异分析检测直肠癌细胞药物敏感性的试剂盒，其特征在于，所述磁性纳米颗粒指示液A的制备方法包括以下步骤： A1：将磁性纳米颗粒利用戊二醛进行表面活化； A2：将活化后的磁性纳米颗粒加入到质量比为1.3-1.5倍的野生P53蛋白抗体溶液中，超声负载1-2h； A3：再加入与所述野生P53蛋白抗体溶液同等体积的绿色荧光蛋白溶液，以及5-10μg/mL的EDC，在pH为7-7.3，温度为2-8℃条件下，反应2-3h，得到经绿色荧光蛋白标记野生P53蛋白抗体进行修饰的磁性纳米颗粒的悬液Ⅰ； A4：向所述悬液Ⅰ中滴加配制液定容至1-5ml。 4.如权利要求1所述的一种基于基因变异分析检测直肠癌细胞药物敏感性的试剂盒，其特征在于，所述磁性纳米颗粒指示液B的制备方法包括以下步骤： B1：将磁性纳米颗粒利用戊二醛进行表面活化； B2：将活化后的磁性纳米颗粒加入到质量比为1.3-1.5倍的抗变异P53蛋白抗体溶液中，超声负载1-2h； B3：再加入与所述抗变异P53蛋白抗体溶液同等体积的红色荧光蛋白溶液，以及5-10μg/mL的EDC，在pH为7-7.3，温度为2-8℃条件下，反应2-3h，得到经红色荧光蛋白标记抗变异P53蛋白抗体进行修饰的磁性纳米颗粒的悬液Ⅱ； B4：向所述悬液Ⅱ中滴加配制液定容至1-5ml。 5.如权利要求3或4所述的一种基于基因变异分析检测直肠癌细胞药物敏感性的试剂盒，其特征在于，所述配制液按照质量百分比计包括：1-2％聚乙二醇、2-3％BSA、0.1-0.2％维生素E、0.3-0.5％茶多酚，余量为0.9％无菌生理盐水。 6.如权利要求1所述的一种基于基因变异分析检测直肠癌细胞药物敏感性的试剂盒，其特征在于，所述底物培养基的配方为：以50-100ml无血清DMEM培养基作为底物，终浓度为220-250ng/mL Wnt/β-连环蛋白、终浓度为30-40ng/mL柚皮柑、终浓度为10-30ng/mL丁酸钠、终浓度为0.5-2nM肠促胰液素、终浓度为75-85ng/mL表皮细胞生长因子、终浓度为1-5μM维生素C、终浓度为15-25mM神经酰胺、终浓度为20-25ng/mL成纤维细胞生长因子、终浓度为60-100ng/mL胶原蛋白多肽、终浓度为180-250μg/mL抗菌剂、终浓度为80-120ng/mL游离氨基酸。 7.如权利要求1所述的一种基于基因变异分析检测直肠癌细胞药物敏感性的试剂盒，其特征在于，所述稀释缓冲液的配方为：100-500ml pH6.8磷酸盐缓冲液、0.5-1ml吐温、0.2g过氧化脲素、0.1g醋酸铵。 8.如权利要求1所述的一种基于基因变异分析检测直肠癌细胞药物敏感性的试剂盒，其特征在于，所述稀释缓冲液的配方为：100-500ml pH6.8磷酸盐缓冲液、0.5-1ml吐温、0.2g过氧化脲素、0.1g醋酸铵。 9.利用权利要求1-8中任意一项所述试剂盒进行直肠癌细胞药物敏感性检测的方法，其特征在于，包括以下步骤： S1：利用OncoQuick分离法分离出检测者外周血中的直肠癌循环肿瘤细胞，将所述直肠癌循环肿瘤细胞均分为A组和B组，并且利用所述稀释缓冲液重悬定容至1ml； S2：在两个培养皿中分别加入3-5ml底物培养基，每个培养皿中单独加入A组或B组的直肠癌循环肿瘤细胞溶液，在A组中加入100μL利用稀释缓冲液1:100稀释的磁性纳米颗粒指示液A，在B组中加入100μL利用稀释缓冲液1:100稀释的磁性纳米颗粒指示液B，37℃孵育培养30min；向A组中加入100μL利用稀释缓冲液1:100稀释的直肠癌细胞药物试剂，B组中则加入100μL稀释缓冲液，37℃孵育培养12h，每隔2h补加1/2体积的底物培养基以及1/2体积的指示液A和指示液B； S3：将S2中孵育后的A组和B组细胞打散过滤成单细胞，利用配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪检测A组和B组细胞中野生P53蛋白的表达量，分别记为X1和X2；利用配备575nm氩离子激光器的流式细胞仪检测A组和B组细胞中变异P53蛋白的表达量，分别记为Y1和Y2； S4：通过公式(1)计算药物敏感值S，公式(1)如下所示：在规定的实验条件下，当S<0.5时，判为药物敏感性低；当S>0.5时，判为药物敏感性高。
所属类别：	发明专利