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原文传递 OLA和MQCA免疫亲和柱及其制备方法与应用

专利名称：	OLA和MQCA免疫亲和柱及其制备方法与应用
摘要：	本发明涉及喹噁啉类化合物的检测，具体涉及OLA和MQCA免疫亲和柱及其制备方法与应用。本发明提供的OLA和MQCA免疫亲和柱，包括偶联有OLA单克隆抗体的固相介质和偶联有MQCA单克隆抗体的固相介质；所述固相介质为CNBr活化的Sepharose 4B；它是由CNBr活化的Sepharose 4B经溶胀后分别与OLA和MQCA的mAb偶联，然后对未偶联的活化位点进行封闭后而获得分别偶联有OLA、MQCA单克隆抗体的固相介质。本发明提供一种OLA和MQCA免疫亲和柱，可以对目标物进行高效净化，回收率高、操作简单。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	北京;11
申请人：	中国计量科学研究院
发明人：	谢洁;龚晓云;翟睿;黄泽建;刘梅英;曾伟杰;江游;戴新华;方向
专利状态：	有效
申请日期：	2019-06-14T00:00:00+0800
发布日期：	2019-09-03T00:00:00+0800
申请号：	CN201910514467.0
公开号：	CN110196321A
代理机构：	北京路浩知识产权代理有限公司
代理人：	王文君;陈征
分类号：	G01N33/531(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	100029 北京市朝阳区北三环东路18号
主权项：	1.一种OLA和MQCA免疫亲和柱，其特征在于，包括位于上部的偶联有OLA单克隆抗体的固相介质和位于下部的偶联有MQCA单克隆抗体的固相介质，二者以筛板隔开；所述固相介质为CNBr活化的Sepharose 4B。 2.根据权利要求1所述的OLA和MQCA免疫亲和柱，其特征在于，所述免疫亲和柱中装填的所述偶联有OLA单克隆抗体的固相介质和偶联有MQCA单克隆抗体的固相介质的厚度均为50mm。 3.一种OLA和MQCA免疫亲和柱的制备方法，其特征在于，包括如下步骤： (1)基质制备：取适量溴化氰活化的琼脂糖干粉Sepharose 4B用1mM盐酸使其溶胀，抽滤，使用1mM HCl洗涤； (2)偶联：使用偶联缓冲液(0.1mol/L NaHCO3,0.5mol/L NaCl,pH 8.4)洗涤步骤1)溶涨后的经CNBr活化的Sepharose 4B；洗涤后，迅速将CNBr活化的Sepharose 4B分别转移到含有适量OLA单克隆抗体的偶联缓冲液中及MQCA单克隆抗体的偶联缓冲液中；混匀，柔和震荡反应；用所述偶联缓冲液分别洗去未偶联的OLA单克隆抗体、MQCA单克隆抗体，分别得到琼脂糖-OLA单抗偶联复合物和琼脂糖-MQCA单抗偶联复合物； (3)封闭活性基团：将所得琼脂糖-OLA单抗偶联复合物和琼脂糖-MQCA单抗偶联复合物分别转入0.1M Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)中，封闭所有残留的活性基团； (4)洗涤：依次用0.1mol/L醋酸-醋酸钠，pH 4.0内含0.5mol/L NaCl的缓冲液和0.1mol/L Tris-HCl，pH 8.0内含0.5mol/L NaCl的缓冲液分别洗涤步骤(3)所得琼脂糖-OLA单抗偶联复合物和琼脂糖-MQCA单抗偶联复合物；以除去偶联后未偶联上的多余的配体；洗涤后用用200mL PBS充分平衡，分别制得偶联有OLA单克隆抗体的固相介质和偶联有MQCA单克隆抗体的固相介质，待用； (5)装柱：下层装填偶联有MQCA单克隆抗体的固相介质，上层装填偶联有OLA单克隆抗体的固相介质。 4.一种OLA和MQCA免疫亲和柱的制备方法，其特征在于，包括如下步骤： (1)基质制备：称取1g基质粉末，溶于5mL 1mmol/L HCl中；基质将会立即溶胀，然后置于砂芯漏斗中使用1mmol/L HCl洗涤15min；使用大约1mmol/L HCl 200mL，分次洗涤； (2)偶联： 1；使用100mL偶联缓冲液(0.1mol/L NaHCO3,0.5mol/L NaCl,pH 8.4)洗涤溶涨后的经CNBr活化的Sepharose 4B，洗涤后，迅速将CNBr活化的Sepharose 4B转移到30mL含有适量OLA或MQCA单克隆抗体的偶联缓冲液中； 2；室温条件下采用end-over-end的方式充分混匀上述的混和物2h，或者在4℃下混匀过夜；也可以采用其他较为轻柔缓和的搅拌方法； 3；在4℃5000rpm离心5min，将sepharose 4B离心至管底，将上清液转移至新的离心管中，冰浴保存，用NanoDrop Onec测定上清液在280nm下的OD值，从而计算偶联率； 4；取离心管底的sepharose 4B，使用至少5倍基质体积的偶联缓冲液进行洗涤，除去多余的配体； (3)封闭 1；封闭所有残留的活性基团；转移基质至50mL 0.1mol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中；室温条件下温和搅拌反应2h或者4℃条件下16h； 2；为除去偶联后未偶联上的多余的配体，依次用低、高两种pH的缓冲液对基质进行洗涤，至少洗涤3个循环，每种缓冲液的使用量至少5倍基质体积；每个洗涤循环步骤：先用0.1mol/L醋酸-醋酸钠，pH 4.0内含0.5mol/L NaCl的缓冲液洗涤，接着再用0.1mol/L Tris-HCl，pH 8.0内含0.5mol/L NaCl的缓冲液进行洗涤；洗涤后的凝胶用200mL PBS充分平衡，待用； (4)装柱：采用湿法装柱，装柱缓冲液为0.02％NaN3-PBS，并用0.02％NaN3-PBS、4℃保存；取3mL空柱管，装好底层筛板，将2mL PBS缓冲液(0.01mol/L pH 7.4)悬浮的MQCA偶联胶装柱，至胶高度为0.5mL，装入中间层筛板，再将2mL PBS缓冲液(0.01mol/L pH 7.4)悬浮的OLA偶联胶装柱，装入顶层筛板，0.02％NaN3-PBS平衡，用塞子和帽子封住底端和上端口，冰箱4℃保存。 5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述OLA和MQCA单克隆抗体通过如下步骤获取： 1)取腹水5mL，加入10mL 0.06mol/L pH5.0的乙酸钠缓冲液，用0.1mol/L HCl调pH至4.8； 2)室温搅拌条件下逐滴加入165μL(1153)辛酸，继续磁力搅拌20min，4℃静置2h，10000rpm4℃离心30min，弃沉淀； 3)上清中加入2mL 0.1mol/L PBS，用1mol/L NaOH调pH至7.4； 4)逐滴加入适量饱和硫酸铵使溶液成45％饱和度(上清液：硫酸铵＝1:1，搅拌30min，期间逐滴加完)，继续搅拌30min后，4℃静置2h；4℃10000rpm离心30min，弃上清； 5)沉淀溶于5mL pH 7.4的PBS中，透析2天，离心后分装，－20℃保存备用。 6.权利要求3-5任一项所述方法制备的OLA和MQCA免疫亲和柱。 7.权利要求1、2、6任一项所述OLA和MQCA免疫亲和柱的性能评价方法，包括最大容量的测定和溶剂加标回收测定。 8.权利要求1、2、6任一项所述的OLA和MQCA免疫亲和柱在OLA和MQCA检测中的应用。 9.OLA和MQCA的检测方法，其特征在于，采用权利要求1、2、6任一项所述的OLA和MQCA免疫亲和柱，具体方法包括样品前处理和采用HPLC-MS/MS法进行检测。
所属类别：	发明专利