详情

原文传递用于单细胞的同时基因组，转录本和蛋白质组分析的组合物和方法

专利名称：	用于单细胞的同时基因组，转录本和蛋白质组分析的组合物和方法
摘要：	本发明公开了用于对单细胞的一种或多种细胞内靶进行多重分析的组合物和方法。本公开的示例性组合物包含表面，所述表面包含与其可操作地连接的多种捕获剂，其中每种捕获剂特异性结合不同的细胞内靶，并且其中所述多种捕获剂形成重复图案；包括多个室的基体，其中所述基体可释放地与所述表面连接，并且其中所述多个室中的每个室包括所述表面的所述多种捕获剂的重复图案的至少一个重复；包含细胞裂解组合物的涂敷组合物；和包含官能化组分和延伸组分的连接体组合物。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	美国;US
申请人：	伊索普莱克西斯公司
发明人：	M·斯里尼瓦桑;C·额;A·凯泽;E·贝蒂尼;P·帕茨科夫斯基;S·麦凯;F·刘
专利状态：	有效
申请日期：	2017-11-13T00:00:00+0800
发布日期：	2019-09-03T00:00:00+0800
申请号：	CN201780069599.6
公开号：	CN110199196A
代理机构：	中国国际贸易促进委员会专利商标事务所
代理人：	郑天松
分类号：	G01N33/543(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	美国康涅狄格
主权项：	1.组合物，其包括：包含多种与其可操作地连接的捕获剂的表面，其中每种捕获剂特异性结合不同的细胞内靶，并且其中所述多种捕获剂形成重复图案；包括多个室的基体，其中所述基体可释放地与所述表面连接，并且其中所述多个室中的每个室包括所述表面的所述多种捕获剂的重复图案的至少一个重复；包含细胞裂解组合物的涂敷组合物；和接头组合物，其包含官能化组分和延伸组分。 2.权利要求1的组合物，其中所述多种捕获剂包含2～200种不同的捕获剂。 3.权利要求1的组合物，其中所述多种捕获剂包含2～100种不同的捕获剂。 4.权利要求1的组合物，其中所述多种捕获剂包含2～50种不同的捕获剂。 5.权利要求1的组合物，其中所述多种捕获剂包含2～25种不同的捕获剂。 6.权利要求1～5之任一项的组合物，其中所述多个室包含2～20,000个室。 7.权利要求1～5之任一项的组合物，其中所述多个室包含2～12,000个室。 8.权利要求1～5之任一项的组合物，其中所述多个室包括2～10,000个室。 9.权利要求1～5之任一项的组合物，其中所述多个室包括2～5,000个室。 10.权利要求1～5之任一项的组合物，其中所述多个室包括2～2,500个室。 11.权利要求1～5之任一项的组合物，其中所述多个室包括2～1,000个室。 12.权利要求1～5之任一项的组合物，其中所述多个室包含2～500个室。 13.权利要求1～12之任一项的组合物，其中所述多个室中的每个室具有相同的形状。 14.权利要求1～13之任一项的组合物，其中所述多个室中的每个室在至少一个尺寸上具有相等的值。 15.权利要求1～14之任一项的组合物，其中所述多个室中的每个室在每个尺寸上具有相等的值。 16.权利要求1～15之任一项的组合物，其中所述多个室中的每个室是圆形的。 17.权利要求16的组合物，其中所述多个室中的每个室具有至少10μm的直径。 18.权利要求16的组合物，其中所述多个室中的每个室具有至少50μm的直径。 19.权利要求16的组合物，其中所述多个室中的每个室具有至少100μm的直径。 20.权利要求17～19之任一项的组合物，其中所述多个室中的每个室具有至少10μm的深度。 21.权利要求17～19之任一项的组合物，其中所述多个室中的每个室具有至少50μm的深度。 22.权利要求17～19之任一项的组合物，其中所述多个室中的每个室具有至少100μm的深度。 23.权利要求1～15之任一项的组合物，其中所述多个室中的每个室是矩形的。 24.权利要求1～15或23之任一项的组合物，其中所述多个室中的每个室具有至少10μm的第一侧的长度。 25.权利要求1～15或23之任一项的组合物，其中所述多个室中的每个室具有至少50μm的第一侧的长度。 26.权利要求1～15或23之任一项的组合物，其中所述多个室中的每个室具有至少100μm的第一侧的长度。 27.权利要求1～15或23～26之任一项的组合物，其中所述多个室中的每个室具有至少10μm的第二侧的长度。 28.权利要求1～15或23～26之任一项的组合物，其中所述多个室中的每个室具有至少50μm的第二侧的长度。 29.权利要求1～15或23～26之任一项的组合物，其中所述多个室中的每个室具有至少100μm的第二侧的长度。 30.权利要求1～15或23～29之任一项的组合物，其中所述多个室中的每个室具有至少10μm的深度。 31.权利要求1～15或23～29之任一项的组合物，其中所述多个室中的每个室具有至少50μm的深度。 32.权利要求1～15或23～29之任一项的组合物，其中所述多个室中的每个室具有至少100μm的深度。 33.权利要求1～32之任一项的组合物，其中所述基体包含聚合物。 34.权利要求33的组合物，其中所述聚合物包括聚二甲基硅氧烷(PDMS)。 35.权利要求34的组合物，其中所述基体具有氧化表面。 36.权利要求34或35的组合物，其中所述PDMS基体由PDMS预聚物与表面活性剂混合形成，然后通过注塑制造。 37.权利要求36的组合物，其中所述表面活性剂包括Triton-X-100。 38.权利要求1～37之任一项的组合物，其中所述表面包含玻璃。 39.权利要求1～38之任一项的组合物，其中所述多种捕获剂中的至少一种捕获剂包含寡核苷酸，适体，抗体，抗体的功能片段或抗体模拟物。 40.权利要求1～38之任一项的组合物，其中所述多种捕获剂中的至少一种捕获剂包含抗体。 41.权利要求1～38之任一项的组合物，其中所述多种捕获剂中的每种捕获剂包含抗体。 42.权利要求1～41之任一项的组合物，其中所述涂敷组合物还包含交联组合物。 43.权利要求42的组合物，其中所述交联组合物包含生物相容性聚合物。 44.权利要求1～43之任一项的组合物，其中所述细胞裂解组合物包含去污剂。 45.权利要求1～44之任一项的组合物，其中所述细胞裂解组合物包含Triton-X-100。 46.权利要求42～45之任一项的组合物，其中所述交联组合物包含聚(乙烯醇)(PVA)。 47.权利要求42～46之任一项的组合物，其中所述交联组合物包含3％v/v PVA，并且所述细胞裂解组合物包含0.2％Triton-X-100。 48.权利要求47的组合物，其中所述交联组合物还包含戊二醛组合物和盐酸(HCl)组合物。 49.权利要求48的组合物，其中所述戊二醛组合物包含0.1％戊二醛。 50.权利要求48或49的组合物，其中HCl组合物包含10％HCl。 51.权利要求1～50之任一项的组合物，其中所述涂敷组合物包含信号传导剂。 52.权利要求1～51之任一项的组合物，其中将所述涂敷组合物配制成多个微球。 53.权利要求1～52之任一项的组合物，其中所述涂敷组合物包含水。 54.权利要求1～52之任一项的组合物，其中所述涂敷组合物不包含水。 55.权利要求1～54之任一项的组合物，其中所述接头组合物在室温下至少1周不降解。 56.权利要求1～54之任一项的组合物，其中所述接头组合物在室温下至少1个月不降解。 57.权利要求1～54之任一项的组合物，其中所述接头组合物在室温下至少6个月不降解。 58.权利要求1～54之任一项的组合物，其中所述接头组合物在室温下至少1年不降解。 59.权利要求1～58之任一项的组合物，其中在与基体接触时，官能化组分将至少一个官能团共价键合到基体的表面上。 60.权利要求59的组合物，其中所述表面包括所述多个室中的每个室的内表面。 61.权利要求59的组合物，其中所述表面包括所述多个室中的每个室的每个内表面。 62.权利要求59～61之任一项的组合物，其中所述至少一种官能团是硅烷基团。 63.权利要求62的组合物，其中所述官能化组分包含有机官能的烷氧基硅烷。 64.权利要求63的组合物，其中所述官能化组分包含氨基硅烷。 65.权利要求63或64的组合物，其中官能化组分包含(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(APTES)。 66.权利要求65的组合物，其中所述官能化组分包含1％APTES。 67.权利要求1～66之任一项的组合物，其中所述延伸组分包含在第一末端与所述官能化组分共价结合的有机聚合物。 68.权利要求67的组合物，其中所述有机聚合物在第二末端包含醛。 69.权利要求42～68之任一项的组合物，其中所述延伸组分与所述交联组合物结合。 70.权利要求1～69之任一项的组合物，其中所述延伸组分包含戊二醛。 71.权利要求70的组合物，其中延伸组分包含1％戊二醛。 72.权利要求1～71之任一项的组合物，其中所述重复图案包括多条平行线。 73.权利要求1～71之任一项的组合物，其中所述重复图案包括多个点。 74.权利要求1～73之任一项的组合物，其中所述细胞内靶是DNA分子、RNA分子、肽、多肽、蛋白质、蛋白质复合物、通道、细胞器、脂质、寡糖、细胞骨架元件。 75.权利要求1～73之任一项的组合物，其中所述细胞内靶是癌基因的转录物、癌蛋白、肿瘤抑制基因的转录物、肿瘤抑制蛋白、癌基因的调节物、癌蛋白的调节物、或肿瘤抑制基因的调节物。 76.权利要求1～73之任一项的组合物，其中所述细胞内靶是受体、酶、转录因子或生长因子。 77.权利要求76的组合物，其中细胞内靶是磷酸化受体或磷酸化酶。 78.权利要求76或77的组合物，其中酶是激酶。 79.权利要求1～78之任一项的组合物，其中所述多个室中的至少一个室还包括官能化带。 80.权利要求1～78之任一项的组合物，其中所述多个室中的每个室还包括官能化带。 81.权利要求79或80所述的组合物，其中所述官能化带捕获珠。 82.权利要求79或80所述的组合物，其中所述官能化带捕获至少一个珠。 83.权利要求79或80所述的组合物，其中所述官能化带捕获至多一个珠。 84.权利要求79～83之任一项的组合物，其中所述官能化带捕获细胞。 85.权利要求79～83之任一项的组合物，其中所述官能化带捕获至少一个细胞。 86.权利要求79～83之任一项的组合物，其中所述官能化带捕获至多一个细胞。 87.权利要求79～86之任一项的组合物，其中所述官能化带捕获一个珠和一个细胞。 88.权利要求79～86之任一项的组合物，其中所述官能化带捕获至多一个珠和至多一个细胞。 89.权利要求79～88之任一项的组合物，其中所述多个室中的至少一个室具有一个或多个尺寸，所述一个或多个尺寸防止第二珠进入所述室或接触所述官能化带。 90.权利要求79～88之任一项的组合物，其中所述多个室中的每个室具有一个或多个尺寸，所述一个或多个尺寸防止第二珠进入所述室或接触所述官能化带。 91.权利要求89或90所述的组合物，其中所述室的一个或多个尺寸大于第一珠的任何尺寸，从而允许所述第一珠进入所述室或接触所述官能化带。 92.权利要求91的组合物，其中所述室的一个或多个尺寸小于所述第一珠的任何尺寸与所述第二珠的任何尺寸的总和，从而防止所述第二珠进入所述室或接触所述官能化带。 93.权利要求89～92之任一项的组合物，其中所述室的一个或多个尺寸是直径，并且其中所述直径是或约是50μm。 94.权利要求93的组合物，其中所述第一珠的直径为30～40μm，包括所述端点，从而允许所述第一珠进入所述室或接触所述官能化带。 95.权利要求94的组合物，其中所述第一珠的直径和所述第二珠的直径之和为60～80μm，从而防止所述第二珠进入所述室或接触所述官能化带。 96.权利要求79～95之任一项的组合物，其中所述官能化带的宽度是10μm或约是10μm。 97.权利要求79～96之任一项的组合物，其中所述包含官能化带的室根据包括以下步骤的方法制备：使所述室的至少一个表面与涂敷组合物接触以产生至少一个涂覆表面，钝化所述室的至少一个涂覆表面以产生至少一个钝化表面；用光掩模掩蔽所述至少一个钝化表面的一部分，其中所述光掩模包括图案，以产生至少一个掩蔽的表面；将至少一个掩蔽的表面暴露于UV光；将捕获抗体组合物沉积在所述室的至少一个掩蔽的表面上以产生至少一个官能化表面，使珠组合物与所述室接触，其中至少一个官能化表面捕获珠，将细胞裂解组合物引入所述室，和将细胞引入所述室。 98.权利要求97的组合物，其中所述包含官能化带的室根据进一步包括以下步骤的方法制备：从所述室中取出珠。 99.权利要求97或98的组合物，其中所述包含官能化带的室根据进一步包括以下步骤的方法制备：在所述室中沉积链霉亲和素组合物，其中所述链霉亲和素组合物在沉积捕获抗体组合物后沉积在所述室中，其中所述链霉亲和素组合物在将所述珠引入所述室之前沉积在所述室中。 100.权利要求79～99之任一项的组合物，其中所述涂敷组合物包含PVA-SbQ组合物。 101.权利要求79～100之任一项的组合物，其中所述抗体组合物包含捕获抗体。 102.权利要求79～101之任一项的组合物，其中在沉积抗体组合物之前，根据包括以下步骤的方法制备至少一个掩蔽的表面：使至少一个掩蔽的表面与接头组合物接触。 103.权利要求102的组合物，其中所述接头组合物包含延伸组分。 104.权利要求103的组合物，其中所述延伸组分包含APTES组合物。 105.权利要求102～104之任一项的组合物，其中所述接头组合物包含官能化组分。 106.权利要求105的组合物，其中所述官能化组分包含蛋白G组合物。 107.权利要求79～106之任一项的组合物，其中所述包含官能化带的室根据包括以下步骤的方法制备：钝化所述室的至少一个表面；用光掩模掩蔽所述至少一个钝化表面的一部分，其中所述光掩模包括图案，以产生至少一个掩蔽的表面；将至少一个掩蔽的表面暴露于UV光；将捕获抗体组合物沉积在所述室中；和将细胞引入所述室。 108.权利要求106的组合物，其中所述钝化步骤包括：接触所述室的至少一个表面和氧等离子体以产生至少一个官能化表面；使所述至少一个官能化表面与预处理组合物接触以产生预处理表面，和使所述至少一个预处理表面与生物素组合物接触。 109.权利要求108的组合物，其中所述预处理组合物包含N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基磺基琥珀酰亚胺钠盐(磺基-NHS)。 110.权利要求109的组合物，其中所述预处理组合物还包含含有0.05M MES和0.5MNaCl的缓冲液。 111.权利要求108～110之任一项的组合物，其中所述生物素组合物包含PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)：聚-L-赖氨酸-g-聚(乙二醇)-生物素(PLL-g-PEG-生物素)。 112.权利要求111的组合物，其中所述生物素组合物还包含HEPES缓冲液。 113.权利要求108～112之任一项的组合物，其中所述预处理组合物包含11.5mg/ml的N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，19.2mg/ml的N-羟基磺基琥珀酰亚胺钠盐(磺基-NHS)和包含0.05M MES和0.5M NaCl缓冲液的缓冲液。 114.权利要求108～113之任一项的组合物，其中所述生物素组合物包含0.5mg/ml的PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)：聚-L-赖氨酸-g-聚(乙二醇)-生物素(PLL-g-PEG-生物素)和10mMHEPES缓冲液。 115.权利要求108～114之任一项的组合物，其中所述钝化步骤包括：接触所述室的至少一个表面和氧等离子体以产生至少一个官能化表面；使至少一个官能化表面与预处理组合物接触15分钟以产生预处理表面，和使至少一个预处理表面与生物素组合物接触至少3小时。 116.权利要求79～115之任一项的组合物，其中所述珠包含含有生物素化的寡核苷酸的组合物。 117.权利要求79～115之任一项的组合物，其中所述细胞组合物包含RNA酶抑制剂溶液。 118.权利要求81～117之任一项的组合物，其中所述珠组合物包含珠和编码条形码的核酸序列，其中所述条形码包含编码条形码的序列和编码条形码柄的序列。 119.权利要求118的组合物，其中编码条形码的核酸序列还包含下列中的一种或多种：编码PCR柄的序列，编码唯一分子标识符(UMI)的序列，编码模板转换寡核苷酸(TSO)柄的序列和编码TSO杂交位点的序列。 120.权利要求118的组合物，其中编码条形码的核酸序列还包含：编码PCR柄的序列，编码唯一分子标识符(UMI)的序列，编码模板转换寡核苷酸(TSO)柄的序列，和编码TSO杂交位点的序列。 121.权利要求118的组合物，其中编码条形码的核酸序列从5'到3'包含：编码PCR柄的序列，编码条形码的序列，编码条形码柄的序列，编码唯一分子标识符(UMI)的序列，编码模板转换寡核苷酸(TSO)柄的序列和编码TSO杂交位点的序列。 122.权利要求118～121之任一项的组合物，其中编码TSO杂交位点的序列包含多聚鸟嘌呤(polyG)序列。 123.权利要求118～121之任一项的组合物，其中编码TSO杂交位点的序列由多聚鸟嘌呤(polyG)序列组成。 124.权利要求118～123之任一项的组合物，其中珠组合物的每个珠包含唯一的条形码。 125.权利要求118～124之任一项的组合物，其中每个室的每个珠包括唯一的条形码。 126.权利要求118～125之任一项的组合物，其中所述多个室中的每个珠包括唯一的条形码。 127.权利要求118～126之任一项的组合物，其中编码条形码的序列包含12个核苷酸。 128.权利要求118～126之任一项的组合物，其中编码条形码的序列由12个核苷酸组成。 129.权利要求118～128之任一项的组合物，其中编码条形码的序列包含至少一个修饰的核苷酸。 130.权利要求129的组合物，其中修饰的核苷酸包含标记。 131.权利要求130的组合物，其中所述标记包括荧光团或发色团。 132.权利要求130的组合物，其中所述标记是荧光标记。 133.权利要求128～132之任一项的组合物，其中编码条形码的序列的每个核苷酸包含标记。 134.权利要求133的组合物，其中每个腺嘌呤包含第一标记，每个胞嘧啶包含第二标记，每个鸟嘌呤包含第三标记，并且每个胸腺嘧啶包含第四标记。 135.权利要求134的组合物，其中所述第一标记，所述第二标记，所述第三标记和所述第四标记是不同的标记。 136.权利要求135的组合物，其中所述第一标记，所述第二标记，所述第三标记和所述第四标记是光谱可区分的荧光标记。 137.权利要求118～136之任一项的组合物，还包含模板转换寡核苷酸(TSO)。 138.权利要求137的组合物，其中TSO包含与编码UMI的序列互补的序列，与编码TSO柄的序列互补的序列，与编码TSO杂交位点的序列的编码序列互补的序列，和与细胞内靶RNA互补的序列。 139.权利要求137的组合物，其中所述细胞内靶RNA是mRNA。 140.权利要求137～139之任一项的组合物，其中与编码TSO的TSO杂交位点的序列互补的序列与编码条形码的核酸的TSO杂交位点的编码序列杂交。 141.权利要求137～140的组合物，还包含细胞内靶RNA。 142.权利要求137～141之任一项的组合物，其中所述细胞内靶RNA与TSO杂交。 143.权利要求137～142之任一项的组合物，还包含正向引物和反向引物，其中正向引物包含与编码PCR柄的序列互补的序列，并且其中第二引物包含与细胞内靶RNA的序列互补的序列。 144.权利要求143的组合物，其中所述反向引物还包含引物特异性识别序列。 145.权利要求137～144之任一项的组合物，其中所述细胞内靶RNA编码T细胞受体(TCR)的组分。 146.权利要求144的组合物，其中所述细胞内靶RNA编码TCR的α-链(TCRα)。 147.权利要求144的组合物，其中所述细胞内靶RNA编码TCR的β-链(TCRβ)。 148.权利要求137～144之任一项的组合物，其中所述细胞内靶RNA编码非天然存在的RNA或mRNA。 149.权利要求147的组合物，其中所述非天然存在的RNA或mRNA包含合成的，修饰的，重组的或嵌合的序列。 150.权利要求147或148的组合物，其中当与野生型形式的序列比较时，所述非天然存在的RNA或mRNA包含突变。 151.权利要求149的组合物，其中所述突变包括取代，插入，缺失，倒位或转座。 152.权利要求147～150之任一项的组合物，其中所述非天然存在的RNA或mRNA编码TCR的组分。 153.权利要求151的组合物，其中所述细胞内靶RNA编码TCR的α-链(TCRα)。 154.权利要求151的组合物，其中所述细胞内靶RNA编码TCR的β-链(TCRβ)。 155.权利要求147～150之任一项的组合物，其中所述非天然存在的RNA或mRNA编码融合蛋白。 156.权利要求147～150或154之任一项的组合物，其中所述非天然存在的RNA或mRNA编码嵌合抗原受体(CAR)。 157.权利要求155的组合物，其中所述CAR从修饰的细胞中释放。 158.权利要求156的组合物，其中所述修饰的细胞是修饰的T细胞。 159.用于对单细胞的一种或多种细胞内靶进行多重分析的方法，包括：在足以引起细胞裂解的条件下使生物样品和权利要求1～157之任一项的组合物接触，以在基体的多个室的每个室内产生细胞裂解物，其中所述多个室中的每个室包括生物样品的单细胞，其中生物样品包括多个细胞和流体，并且其中在所述多个室的每个室内，所述生物样品与所述表面流体连通；将所述多个室的每个室内的细胞裂解物温育足够的时间以允许多种捕获剂中的至少一种捕获剂特异性结合至少一种细胞内靶以产生捕获剂:靶复合物；和使至少一种捕获剂:靶复合物可视化以在多重分析中鉴定单细胞的一种或多种细胞内靶。 160.权利要求158的方法，其中所述单细胞是健康细胞。 161.权利要求158的方法，其中所述单细胞是肿瘤细胞。 162.权利要求158或160的方法，其中所述单细胞是恶性细胞。 163.权利要求158～161之任一项的方法，其中所述单细胞是神经细胞。 164.权利要求158～162之任一项的方法，其中所述单细胞是神经胶质细胞。 165.权利要求158～161之任一项的方法，其中所述单细胞是免疫细胞。 166.权利要求164的方法，其中所述单细胞是T淋巴细胞或B淋巴细胞。 167.权利要求158～161之任一项的方法，其中所述单细胞是细菌。 168.权利要求158～161之任一项的方法，其中所述单细胞是古细菌。 169.权利要求158～161之任一项的方法，其中所述单细胞是酵母细胞。 170.权利要求158～161之任一项的方法，其中所述单细胞是藻类。 171.权利要求158、159、162、163或166～169的方法，其中所述单细胞是被遗传修饰的。 172.权利要求158～170之任一项的方法，其中所述生物样品获自受试者。 173.权利要求171的方法，其中所述生物样品包括血液，脑脊液(CSF)，淋巴液，胸腔积液，尿液或唾液。 174.权利要求171或172的方法，其中所述生物样品包含细胞培养基。 175.权利要求171～173之任一项的方法，其中所述生物样品包括组织样品或组织活检。 176.权利要求171～173之任一项的方法，其中所述受试者是健康的。 177.权利要求171～173之任一项的方法，其中所述受试者患有癌症。 178.权利要求171～173之任一项的方法，其中所述受试者患有感染。 179.权利要求171～173之任一项的方法，其中所述受试者患有自身免疫疾病。 180.权利要求171～173之任一项的方法，其中所述受试者患有炎性疾病。 181.权利要求171～173之任一项的方法，其中所述受试者患有神经障碍。 182.权利要求171～173之任一项的方法，其中所述受试者患有代谢病症。 183.权利要求171～173之任一项的方法，其中所述受试者患有退行性疾病。 184.权利要求171～173之任一项的方法，其中所述受试者具有与疾病或病症相关的基因突变或表观遗传修饰。 185.权利要求158～183之任一项的方法，其中所述可视化包括：使至少一种捕获剂:靶复合物与标记的第二抗体接触，所述第二抗体结合所述捕获剂，及检测所述标记的第二抗体。 186.权利要求184的方法，其中所述标记的第二抗体包含荧光，金或银标记。 187.权利要求184或185的方法，其中所述可视化包括：使第一捕获剂:靶复合物与结合第一捕获剂的第一标记的第二抗体接触，使第二捕获剂:靶复合物与结合第二捕获剂的第二标记的第二抗体接触，和检测第一标记的第二抗体和第二标记的第二抗体，其中第一标记的第二抗体和第二标记的第二抗体各自包含不同的标记。 188.权利要求184～186之任一项的方法，其中所述方法还包括定量所述至少一种细胞内靶。 189.权利要求187的方法，其中所述定量步骤包括测量所述标记的第二抗体的强度和/或密度。 190.权利要求187或188的方法，其中所述细胞内靶是磷蛋白。 191.用于对单细胞的一种或多种细胞内靶进行多重分析的方法，包括：在足以引起细胞裂解的条件下使生物样品和权利要求79～157之任一项的组合物接触，以在基体的多个室的每个室内产生细胞裂解物，其中所述多个室中的每个室包含生物样品的单细胞，其中生物样品包含多个细胞和流体，其中在所述多个室的每个室内，所述生物样品与珠流体连通，并且其中所述珠包含特异性结合至少一种细胞内靶的多种捕获剂，以产生捕获剂:靶复合物；将多个室的每个室内的细胞裂解物温育足够的时间以允许所述多种捕获剂中的至少一种捕获剂特异性结合至少一种细胞内靶以产生捕获剂:靶复合物；和使至少一种捕获剂:靶复合物可视化或对至少一种捕获剂:靶复合物的靶进行测序，以在多重分析中鉴定单细胞的一种或多种细胞内靶。 192.权利要求190的方法，其中所述方法包括使至少一种捕获剂:靶复合物可视化和对所述至少一种捕获剂:靶复合物的靶进行测序，以在多重分析中鉴定单细胞的一种或多种细胞内靶。 193.权利要求190的方法，其中所述方法包括使至少一种捕获剂:靶复合物可视化或对所述至少一种捕获剂:靶复合物的靶进行测序，以在多重分析中鉴定单细胞的一种或多种细胞内靶。 194.权利要求190的方法，其中所述方法包括对所述至少一种捕获剂:靶复合物的靶进行测序，以在多重分析中鉴定单细胞的一种或多种细胞内靶。 195.权利要求190或192的方法，其中所述方法包括对所述至少一种捕获剂:靶复合物的靶进行测序，以在多重分析中鉴定单细胞的一种或多种细胞内靶。 196.权利要求190的方法，其中所述珠组合物包含珠和编码条形码的核酸序列，其中所述条形码包含编码条形码的序列和编码条形码柄的序列，并且其中所述方法包括通过合成cDNA条形码序列来对所述条形码进行测序。 197.权利要求195的方法，其中合成条形码包括在足以进行杂交和cDNA合成的条件下，使编码条形码柄的序列，包含与编码条形码柄的序列的一部分互补的序列的引物和聚合酶接触，其中接触产生cDNA条形码序列。 198.权利要求195或196的方法，其中所述测序步骤在所述室中进行。 199.权利要求195～197之任一项的方法，其中编码条形码的核酸序列还包含下列中的一种或多种：编码PCR柄的序列，编码唯一分子标识符(UMI)的序列，编码模板转换寡核苷酸(TSO)柄的序列和编码TSO杂交位点的序列。 200.权利要求195～197之任一项的方法，其中编码条形码的核酸序列还包含编码PCR柄的序列，编码唯一分子标识符(UMI)的序列，编码模板转换寡核苷酸(TSO)柄的序列和编码TSO杂交位点的序列。 201.权利要求195～197之任一项的方法，其中编码条形码的核酸序列从5'到3'包含：编码PCR柄的序列，编码条形码的序列，编码条形码柄的序列，编码唯一分子标识符(UMI)的序列，编码模板转换寡核苷酸(TSO)柄的序列和编码TSO杂交位点的序列。 202.权利要求195～200之任一项的方法，其中编码TSO杂交位点的序列包含多聚鸟嘌呤(polyG)序列。 203.权利要求195～200之任一项的方法，其中编码TSO杂交位点的序列由多聚鸟嘌呤(polyG)序列组成。 204.权利要求195～200之任一项的方法，其中珠组合物的每个珠包含唯一的条形码。 205.权利要求195～200之任一项的方法，其中每个室的每个珠包括唯一的条形码。 206.权利要求195～200之任一项的方法，其中所述多个室中的每个珠包括唯一的条形码。 207.权利要求195～205之任一项的方法，其中编码条形码的序列包含12个核苷酸。 208.权利要求195～205之任一项的方法，其中编码条形码的序列由12个核苷酸组成。 209.权利要求195～207之任一项的方法，其中足以进行杂交和cDNA合成的条件包括多种脱氧核苷酸(dNTP)。 210.权利要求208之任一项的方法，其中所述多种脱氧核苷酸(dNTP)中的至少一种dNTP包含修饰。 211.权利要求208之任一项的方法，其中所述多种脱氧核苷酸(dNTP)中的每种dNTP包含修饰。 212.权利要求210的方法，其中所述修饰包括标记。 213.权利要求211的方法，其中所述标记包括荧光团或发色团。 214.权利要求211的方法，其中所述标记是荧光标记。 215.权利要求210～213之任一项的方法，其中每个腺嘌呤包含第一标记，每个胞嘧啶包含第二标记，每个鸟嘌呤包含第三标记，并且每个胸腺嘧啶包含第四标记。 216.权利要求214的方法，其中所述第一标记，所述第二标记，所述第三标记和所述第四标记是不同的标记。 217.权利要求215的方法，其中所述第一标记，所述第二标记，所述第三标记和所述第四标记是光谱可区分的荧光标记。 218.cDNA条形码序列，其由权利要求195～217之任一项的方法产生。 219.组合物，其包含权利要求217的cDNA条形码序列。 220.权利要求195～218之任一项的方法，还包括在足以使TSO与编码条形码的核酸的一部分杂交的条件下使编码珠条形码的核酸序列和TSO接触，以产生核酸/TSO双链体。 221.权利要求219的方法，其中所述TSO包含与编码UMI的序列互补的序列，与编码TSO柄的序列互补的序列，与编码TSO杂交位点的序列的编码序列互补的序列，和与细胞内靶RNA互补的序列。 222.权利要求220的方法，其中所述细胞内靶RNA是mRNA。 223.权利要求219～221之任一项的方法，其中与编码TSO的TSO杂交位点的序列互补的序列与编码条形码的核酸的TSO杂交位点的编码序列杂交。 224.权利要求219～222之任一项的方法，其中TSO与细胞内靶RNA杂交以形成核酸:TSO:细胞内靶RNA三链体。 225.权利要求223的方法，还包括在足以进行杂交和扩增的条件下使核酸:TSO:细胞内靶RNA三链体，正向引物，反向引物和聚合酶接触，其中正向引物包含与编码条形码的核酸的PCR柄的编码序列互补的序列，其中第二引物包含与细胞内靶RNA的序列互补的序列，以产生扩增产物。 226.权利要求224的方法，其中扩增产物包括编码条形码的序列，编码条形码柄的序列，编码UMI的序列，编码TSO柄的测序，编码TSO杂交位点的序列和编码细胞内靶RNA的序列。 227.权利要求224或225的方法，还包括在足以进行杂交和扩增的条件下使所述扩增产物与第二正向引物，第二反向引物和聚合酶接触，其中所述第二正向引物包含与编码扩增产物的PCR柄的序列互补的序列，并且其中所述第二反向引物包含与扩增产物的细胞内靶RNA的序列互补的序列，以产生第一测序产物。 228.权利要求226的方法，其中所述第二反向引物还包含引物特异性识别序列。 229.权利要求220～228之任一项的方法，其中所述细胞内靶RNA编码T细胞受体(TCR)的组分。 230.权利要求228的方法，其中所述细胞内靶RNA编码TCR的α-链(TCRα)。 231.权利要求228的方法，其中所述细胞内靶RNA编码TCR的β-链(TCRβ)。 232.权利要求220～230之任一项的方法，其中所述细胞内靶RNA编码非天然存在的RNA或mRNA。 233.权利要求231的方法，其中所述非天然存在的RNA或mRNA包含合成的，修饰的，重组的或嵌合的序列。 234.权利要求231或232的方法，其中当与野生型形式的序列比较时，所述非天然存在的RNA或mRNA包含突变。 235.权利要求233的方法，其中所述突变包括取代，插入，缺失，倒位或转座。 236.权利要求231～234之任一项的方法，其中所述非天然存在的RNA或mRNA编码TCR的组分。 237.权利要求235的方法，其中所述细胞内靶RNA编码TCR的α-链(TCRα)。 238.权利要求235的方法，其中所述细胞内靶RNA编码TCR的β-链(TCRβ)。 239.权利要求231～237之任一项的方法，其中所述非天然存在的RNA或mRNA编码融合蛋白。 240.权利要求231～234或238之任一项的方法，其中所述非天然存在的RNA或mRNA编码嵌合抗原受体(CAR)。 241.权利要求239的方法，其中所述CAR从修饰的细胞中释放。 242.权利要求240的方法，其中所述修饰的细胞是修饰的T细胞。 243.权利要求158或159的方法，其中所述可视化包括：使至少一种捕获剂:靶复合物与标记的第二抗体接触，所述第二抗体结合捕获剂，和检测标记的第二抗体。 244.权利要求242的方法，其中所述标记的第二抗体包含荧光，金或银标记。 245.权利要求242或243的方法，其中所述可视化包括：使第一捕获剂:靶复合物与结合第一捕获剂的第一标记的第二抗体接触，使第二捕获剂:靶复合物与结合第二捕获剂的第二标记的第二抗体接触，和检测第一标记的第二抗体和第二标记的第二抗体，其中第一标记的第二抗体和第二标记的第二抗体各自包含不同的标记。 246.权利要求158～244之任一项的方法，其中所述方法还包括定量所述至少一种细胞内靶。 247.权利要求245的方法，其中所述定量步骤包括测量所述标记的第二抗体的强度和/或密度。 248.权利要求245的方法，其中所述定量步骤包括在预定数量的扩增循环后测量转录物的丰度。 249.权利要求247的方法，其中所述扩增包括定量聚合酶链式反应。
所属类别：	发明专利