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原文传递一种高度特异性的单分子荧光检测方法

专利名称：	一种高度特异性的单分子荧光检测方法
摘要：	本发明公开了一种高度特异性的单分子荧光检测方法。所述单分子检测方法包括如下步骤：(1)将两条识别探针与待检测的目标物结合，形成复合物；(2)将捕获探针固定于玻片上，并加入复合物，捕获探针与一条识别探针结合；(3)向玻片上加入带荧光标记的信号探针，信号探针与两条识别探针动态结合；(4)将玻片置于显微镜载物台上进行监测，利用电子增强型相机记录单分子荧光时间影像序列，筛选得到荧光强度‑时间轨迹呈现ON‑OFF交替变化且荧光的ton和toff相对较短的单分子点即为目标物。本发明能够在单分子水平直接指认目标物分子，高度可信的区分目标物与非目标物，可以大幅度提高单分子荧光检测的灵敏度、特异性和重复性。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	北京;11
申请人：	北京化工大学
发明人：	苏昕;蔡爽;喻长远;李丽丹;邓莹楠
专利状态：	有效
申请日期：	2019-04-15T00:00:00+0800
发布日期：	2019-09-06T00:00:00+0800
申请号：	CN201910299030.X
公开号：	CN110208226A
代理机构：	北京纪凯知识产权代理有限公司
代理人：	王春霞
分类号：	G01N21/64(2006.01);G;G01;G01N;G01N21
申请人地址：	100029 北京市朝阳区北三环东路15号
主权项：	1.一种单分子荧光检测探针系统，包括带荧光标记的信号探针和能与待检测的目标物结合的两条识别探针；当两条所述识别探针均与待检测的目标物结合时，会诱导两条所述识别探针与所述信号探针之间的结合稳定度的变化，即荧光强度-时间轨迹呈现ON-OFF交替变化。 2.根据权利要求1所述的探针系统，其特征在于：一条所述识别探针由捕获探针结合域、目标物结合域、短互补桥和信号探针接收臂构成；另一条所述识别探针由目标物结合域、短互补桥和信号探针接收臂构成；一条所述识别探针通过所述捕获探针结合域与捕获探针形成稳定结合；两条所述识别探针均通过所述目标物结合域与目标物形成稳定结合；两条所述识别探针均通过所述信号探针接收臂与所述信号探针形成动态结合。 3.根据权利要求1或2所述的探针系统，其特征在于：所述信号探针与所述信号探针接收臂互补的碱基个数为5～7个；所述信号探针与所述信号探针接收臂相互作用区段的GC含量≤50％；将荧光基团修饰于所述信号探针相对于待检测的目标物的远端；所述荧光基团为Cy3荧光基团。 4.一种单分子检测方法，包括如下步骤： (1)将两条识别探针与待检测的目标物结合，形成复合物； (2)将捕获探针固定于玻片上，并加入所述复合物，所述捕获探针与一条所述识别探针结合； (3)向所述玻片上加入带荧光标记的信号探针，所述信号探针与两条所述识别探针动态结合； (4)将所述玻片置于显微镜载物台上进行监测，利用电子增强型相机记录单分子荧光时间影像序列，筛选得到荧光强度-时间轨迹呈现若干次ON-OFF交替变化且荧光的ton和toff相对较短的单分子点即为目标物；所述ON-OFF交替变化指的是所述信号探针结合时表现的荧光ON状态与其解离时表现的荧光OFF状态的交替变化；所述ton指的是荧光ON状态持续的时间，所述toff指的是荧光OFF状态持续的时间。 5.根据权利要求4所述的单分子检测方法，其特征在于：所述信号探针与每条所述识别探针的接收臂互补的碱基个数为5～7个；所述信号探针与所述识别探针的接收臂相互作用区段的GC含量≤50％。 6.根据权利要求4或5所述的单分子检测方法，其特征在于：将荧光基团修饰于所述信号探针相对于待检测的目标物的远端；所述荧光基团为Cy3荧光基团；所述捕获探针与所述识别探针之间互补的碱基个数至少为20个。 7.根据权利要求4-6中任一项所述的单分子检测方法，其特征在于：步骤(1)中，形成所述复合物的条件如下：温度为20～27℃，时间为30～60分钟； 8.根据权利要求4-7中任一项所述的单分子检测方法，其特征在于：步骤(4)中，在监测时间500s内荧光状态变化次数大于3次的单分子点为所述目标物；当所述信号探针结合时与其解离时的荧光强度差异>1000且信噪比>3时的单分子点为所述目标物。 9.权利要求1-3中任一项所述单分子荧光检测探针系统检测下述单分子中的应用：寡聚核苷酸、蛋白质和小分子。 10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：利用固定于玻片表明的捕获探针与所述识别探针结合。
所属类别：	发明专利