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原文传递有机磷类和氨基甲酸酯类农药残留检测方法及其试纸条和制备方法

专利名称：	有机磷类和氨基甲酸酯类农药残留检测方法及其试纸条和制备方法
摘要：	本发明提供了一种有机磷类和氨基甲酸酯类农药残留检测方法，包括以下步骤：通过动物细胞进行重组人乙酰胆碱酯酶的表达，重组人乙酰胆碱酯酶纯化后用胶体金进行标记，农药完全抗原与农药小分子竞争性地与重组人乙酰胆碱酯酶结合；将胶体金标记的重组人乙酰胆碱酯酶、农药完全抗原、重组人乙酰胆碱酯酶抗体等组装成试纸条；需要检测的样品经前处理后，用提取溶剂提取，得到样品溶液，将适量样品溶液滴加到样品垫上，样品溶液将会向吸水垫端移动，待3～15分钟后，根据检测线和控制线的显色情况，判断样品中是否含有有机磷类或氨基甲酸酯类农药残留。本发明可对大部分有机磷类和氨基甲酸酯类农药进行特异性识别，检测范围宽，灵敏度高。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	广东;44
申请人：	广东志道医药科技有限公司
发明人：	冯锐;王丁力;龙飞;方铁铮;杨凯
专利状态：	有效
申请日期：	2018-02-27T00:00:00+0800
发布日期：	2019-09-03T00:00:00+0800
申请号：	CN201810160607.4
公开号：	CN110196322A
分类号：	G01N33/558(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	528051 广东省佛山市禅城区张槎一路127号1座3层P11
主权项：	1.一种有机磷类和氨基甲酸酯类农药残留检测方法，包括以下步骤： (1)通过动物细胞进行重组人乙酰胆碱酯酶的表达，重组人乙酰胆碱酯酶纯化后用胶体金进行标记，农药完全抗原与农药小分子竞争性地与重组人乙酰胆碱酯酶结合； (2)将胶体金标记的重组人乙酰胆碱酯酶、农药完全抗原、重组人乙酰胆碱酯酶抗体等组装成有机磷类和氨基甲酸酯类农药残留检测试纸条；所述试纸条由样品垫、金标垫、检测线、控制线、硝基纤维素膜、吸水垫、PVC底板组成； (3)需要检测的样品经前处理后，用提取溶剂提取，得到样品溶液，将适量样品溶液滴加到样品垫上，样品溶液将会向吸水垫端移动；待3～15分钟后，根据检测线和控制线的显色情况，判断样品中是否含有有机磷类或氨基甲酸酯类农药残留，判断方法如下： 1)检测线显红色，控制线显红色——阴性结果，样品中不含有机磷类和氨基甲酸酯类农药； 2)检测线不显红色，控制线显红色——阳性结果，样品中含有有机磷类或氨基甲酸酯类农药； 3)无论检测线显不显红色，控制线不显红色——试纸条失效；其中步骤(2)中，所述试纸条也可以将上述的金标垫去除，将胶体金标记的重组人乙酰胆碱酯酶以固体或液体存放于容器中；其中步骤(3)中，也可以将适量样品溶液滴加到重组人乙酰胆碱酯酶容器中，充分混合，将不含金标垫的试纸条插入容器中。 2.根据权利要求书1所述的有机磷类和氨基甲酸酯类农药残留检测方法，其特征在于：步骤(1)中，所述动物细胞为CHO-DG44。 3.根据权利要求书1所述的有机磷类和氨基甲酸酯类农药残留检测方法，其特征在于：步骤(1)中，所述重组人乙酰胆碱酯酶的表达的方法如下：根据人的乙酰胆碱酯酶的氨基酸序列，通过密码子优化、信号肽和标签修改等技术对基因加以适当改动，设计合成乙酰胆碱酯酶新的基因片段AChE，将新设计的AChE基因融合至哺乳动物细胞表达载体pMPT中，转染至CHO-DG44细胞中，经过筛选，得到稳定表达细胞池，此细胞能够生产和表达与天然人乙酰胆碱酯酶具有相同生物活性的重组人乙酰胆碱酯酶。 4.根据权利要求书1所述的有机磷类和氨基甲酸酯类农药残留检测方法，其特征在于：步骤(1)中，所述重组人乙酰胆碱酯酶的纯化，包括以下步骤：离心取细胞培养液上清，过滤除去不溶颗粒物后，以镍柱捕获其中的重组人乙酰胆碱酯酶，以含有梯度浓度咪唑的缓冲液洗脱结合在镍柱上的重组人乙酰胆碱酯酶，以透析或其他方法除去重组人乙酰胆碱酯酶溶液中的咪唑，将重组人乙酰胆碱酯酶溶液浓缩至所需浓度。 5.根据权利要求书1所述的有机磷类和氨基甲酸酯类农药残留检测方法，其特征在于：步骤(1)中，所述农药完全抗原由小分子半抗原与BSA或OVA偶联制得，其中小分子半抗原可以是修饰或未修饰的有机磷类农药小分子、修饰或未修饰的氨基甲酸酯类农药小分子、有机磷类农药通用半抗原、氨基甲酸酯类农药通用半抗原。 6.根据权利要求书1所述的有机磷类和氨基甲酸酯类农药残留检测方法，其特征在于：步骤(2)中，所述重组人乙酰胆碱酯酶抗体由上述重组人乙酰胆碱酯酶免疫鼠、兔、羊等动物制得。 7.根据权利要求书1所述的有机磷类和氨基甲酸酯类农药残留检测方法，其特征在于：步骤(3)中，所述提取溶剂为含0％～20％乙醇的pH为6～8的PBS缓冲液。 8.一种由权利要求1～7任意一项所述有机磷类和氨基甲酸酯类农药残留检测试纸条，其特征在于：所述试纸条由样品垫、金标垫、检测线、控制线、硝基纤维素膜、吸水垫、PVC底板组成，所述样品垫、金标垫、检测线、控制线、硝基纤维素膜、吸水垫均设置在PVC底板的上方，样品垫设置在PVC底板的边缘，金标垫与样品垫有部分重叠，金标垫和吸水垫分别与硝基纤维素膜两端部分重叠，硝基纤维素膜上靠近金标垫的一端喷涂有检测线，硝基纤维素膜靠近吸水垫的一端喷涂有控制线，金标垫上包被有胶体金标记的重组人乙酰胆碱酯酶，检测线包被农药完全抗原，控制线上包被重组人乙酰胆碱酯酶抗体；所述试纸条也可以将上述的金标垫去除，将胶体金标记的重组人乙酰胆碱酯酶以固体或液体存放于容器中。 9.根据权利要求书8所述的有机磷类和氨基甲酸酯类农药残留检测试纸条，其特征在于：所述样品垫和金标垫为玻璃纤维膜，所述吸水垫为滤纸。 10.一种由权利要求8～9任意一项所述有机磷类和氨基甲酸酯类农药残留检测试纸条的制备方法，其特征在于：包括以下步骤： (1)制备农药完全抗原：将农药半抗原与牛血清白蛋白(BSA)或卵清白蛋白(OVA)，通过碳二亚胺法、活化酯法、混合酸酐法、重氮化法或戊二醛法等方法进行偶联，制备农药半抗原-BSA偶联物与农药半抗原-OVA偶联物，即农药完全抗原； (2)制备重组人乙酰胆碱酯酶：以CHO-DG44表达，以固定化金属离子亲和色谱(IMAC)对含有组氨酸标签的重组人乙酰胆碱酯酶进行纯化，SDS-PAGE纯度>90％； (3)制备胶体金：以柠檬酸三钠还原法制备胶体金，胶体金颗粒直径在20～60nm之间； (4)胶体金标记抗体：将胶体金溶液与重组人乙酰胆碱酯酶按1μg/mL～20μg/mL的比例混匀，通过离心纯化、浓缩，制备成胶体金标记的重组人乙酰胆碱酯酶； (5)将胶体金标记的重组人乙酰胆碱酯酶喷涂并固定在金标垫上，或将胶体金标记的重组人乙酰胆碱酯酶以固体或液体形式保存于微孔等容器中，将农药完全抗原包被在检测线上，将重组人乙酰胆碱酯酶抗体包被在控制线上，并充分干燥； (6)将硝基纤维素膜、金标垫、样品垫、吸水垫依次粘合在PVC底板上，切成条状，即制成检测有机磷类和氨基甲酸酯类农药残留的试纸条。
所属类别：	发明专利