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原文传递一种PCV3的荧光免疫层析检测卡的制备方法

专利名称：	一种PCV3的荧光免疫层析检测卡的制备方法
摘要：	本发明公开了一种PCV3的荧光免疫层析检测卡的制备方法，在粘性底板上依次粘贴样品垫、结合垫（固定抗体）、层析膜和吸水纸，还包括PCV3单克隆抗体的配对标记，是取多支PCV3单克隆抗体分别标记荧光微球，采用双抗体夹心原理：在硝酸纤维膜上的测试区包被抗PCV3抗原单克隆抗体、质控区包被的鸡IgY，荧光标记另外一株PCV3单克隆抗体和羊抗鸡IgY。本发明的优点在于，不需要接种实验室仪器，检测时间快速，检测结果可见。与层析免疫方法不同的是，荧光免疫层析技术采用荧光微球作为标记物，每个微球中可包裹成千上万个荧光分子，大大提高了标记效率，有效的提高了灵敏度；同时荧光微球表面修饰有合适密度的羧基，用于与蛋白或抗体的共价偶联，提高标记物的稳定性。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	广东;44
申请人：	华南农业大学
发明人：	蒋再学;罗满林;吴佳俊;蒋梅;卜婉迪;肖丽
专利状态：	有效
申请日期：	2019-04-26T00:00:00+0800
发布日期：	2019-08-27T00:00:00+0800
申请号：	CN201910341732.X
公开号：	CN110174510A
代理机构：	桂林市华杰专利商标事务所有限责任公司
代理人：	杨雪梅
分类号：	G01N33/533(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	510642 广东省广州市天河区五山路483号
主权项：	1.一种PCV3的荧光免疫层析检测卡的制备方法，在粘性底板上依次粘贴样品垫、结合垫、层析膜和吸水纸，其特征在于：还包括PCV3单克隆抗体的配对标记，是取多支PCV3单克隆抗体分别标记荧光微球，具体步骤如下：（1）将20μL荧光微球溶于500μL的100 nM pH 6.2磷酸二氢钠缓冲液，加入10μL的50 mM1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和10μL 的50 mM N-羟基琥珀酰亚胺反应20min，使微荧光球表面羧基基团活化；（2）活化后，置于4℃下，以17500 rpm离心1 h后弃上清，加入500μL的 50 mM 2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液，以100 W的功率超声重悬3次，每次工作时间3秒，间隔时间3秒，使之分散；（3）分散后，加入40μg PCV3单克隆抗体，使PCV3单克隆抗体与荧光微球表面羧基基团偶联，室温震荡反应2h；（4）震荡反应后，加入50μL含10%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液，用于封闭微球上未标记单克隆抗体的羧基基团，15℃~25℃震荡反应10 min；（5）震荡反应后，以17500 rpm离心45min，离心后弃上清，加入500μL微球重悬液，以100W的功率超声重悬3次，每次工作时间3秒，间隔时间3秒，使之分散，置于4℃环境保存；所述样品垫的制备是将其浸泡于样品垫处理液中，1h后取出，置于室温干燥16 h ~18h；所述层析膜的制备是将多支PCV3单克隆抗体做为检测抗体分别与羊抗鸡单克隆抗体包被于层析膜，具体步骤如下：（A）用含0.5%海藻糖的pH7.4的磷酸缓冲盐溶液稀释PCV3单克隆抗体至终浓度1.0mg/mL，用pH7.4的磷酸缓冲盐溶液稀释羊抗鸡单克隆抗体至终浓度1.0 mg/mL；（B）将稀释后的PCV3单克隆抗体按1.2 μL/cm的包被量包被在层析膜上，作为检测T线区域；（C）将稀释后的羊抗鸡单克隆抗体按1.0 μL/cm的包被量包被在层析膜上，作为质控C线区域；（D）包被后层析膜置于37℃烘3 h，再置于15℃~25℃干燥环境下保存；所述PCV3的荧光免疫层析检测卡的组装，将样品垫、结合垫、层析膜和吸水纸依次粘贴在底板上，样品垫的始端与粘性底板的始端对齐，吸水纸的末端与粘性底板的末端对齐，层析膜上检测T线区域和质控C线区域均为与所述吸水纸的水平方向垂直的条状带；检测T线区域位于近结合垫的一侧；质控C线区域位于近吸水纸的一侧；将吸水纸用机器切成条，装在特制的塑料卡中，形成检测卡。 2.根据权利要求1所述的PCV3的荧光免疫层析检测卡的制备方法，其特征在于：所述微球重悬液是将荧光微球重悬于硼酸盐缓冲液制备而成；所述样品垫处理液由含有0.05v/v％Tween 20、5w/v％蔗糖、0.5v/v％Triton X 100、0.5w/v％BSA的0.01mol/L PBS溶液混合而成。
所属类别：	发明专利