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原文传递一种石墨烯/聚苯胺纳米线阵列免疫传感器的制备方法及应用

专利名称：	一种石墨烯/聚苯胺纳米线阵列免疫传感器的制备方法及应用
摘要：	本发明涉及一种石墨烯/聚苯胺纳米线阵列免疫传感器的制备方法及应用，属于生物传感技术领域；本发明采用电致化学发光技术，以降钙素原为分析物模型，以钯杂化石墨烯/聚苯胺纳米阵列结构作为传感平台，以鲁米诺为电化学发光信号源，以羧基化铈掺杂二硫化锡作为二抗标记物，提出了一种电致化学发光传感器的制备方法，该方法具有制备简单、成本低的优点，弥补了传统检测技术操作复杂、成本高、耗时长的缺点，基于该方法研制的传感器应用于降钙素原的实际样品检测，具有灵敏度高、特异性强、响应迅速、便携的优点，其检出限低至1.2 fg/mL，线性范围宽至5fg/mL—50 ng/mL，在降钙素原的早期临床检测中具有大的潜在应用价值。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	山东;37
申请人：	济南大学
发明人：	魏琴;杨磊;张诺;李玉阳;冯瑞卿;张勇;范大伟
专利状态：	有效
申请日期：	2019-06-18T00:00:00+0800
发布日期：	2019-09-13T00:00:00+0800
申请号：	CN201910524613.8
公开号：	CN110231336A
代理机构：	济南誉丰专利代理事务所(普通合伙企业)
代理人：	李茜
分类号：	G01N21/76(2006.01);G;G01;G01N;G01N21
申请人地址：	250022 山东省济南市市中区南辛庄西路336号
主权项：	1.一种石墨烯/聚苯胺纳米线阵列免疫传感器的制备方法及应用，其特征在于，包括以下步骤：（1）将直径为4 mm的玻碳电极依次用1.0 μm、0.3 μm、0.05 μm氧化铝做抛光处理，用超纯水冲洗干净；（2）在玻碳电极表面滴加6 μL、浓度为2 ~ 4 mg/mL捕获抗体Ab1标记的钯杂化石墨烯/聚苯胺溶液，置于4 °C下晾干；（3）滴加3 μL、质量分数为1 ~ 3%的牛血清白蛋白溶液，以封闭电极表面的非特异性活性位点，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液冲洗电极表面，置于4 °C晾干；（4）滴加6 μL降钙素原的标准溶液或未知浓度的溶液，37 °C下孵化0.5 ~ 2 h，用pH7.4的磷酸盐缓冲溶液冲洗电极表面，置于4 °C晾干；（5）滴加6 μL、浓度为2 ~ 4 mg/mL的检测抗体Ab2标记的铈掺杂二硫化锡-鲁米诺溶液，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液冲洗电极表面，置于4 °C晾干，传感器构建完毕。 2.如权利要求1所述的一种石墨烯/聚苯胺纳米线阵列免疫传感器的制备方法及应用，所述捕获抗体Ab1标记的钯杂化石墨烯/聚苯胺溶液，其特征在于，制备步骤如下：（1）向0.13 ~ 0.15 g的四氯钯酸钠与0.13 ~ 0.15 g的柠檬酸钠固体中，加入30 ~ 50mL的去离子水，将混合固体均匀溶解，然后，将0.5 ~ 0.7 mL的硼氢化钠溶液逐滴加入混合液，最后，通过持续搅拌得到黑色的钯纳米粒子，避光储存于4 °C下；（2）将0.4 ~ 0.6 g氧化石墨烯加入含有90 ~ 110 mL无水二甲基甲酰胺的烧杯当中，随后，在冰水浴的条件下，取2.78 ~ 2.98 g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐加入到上悬浮液中，并且在氮气氛围下搅拌1 ~ 3 h，然后加入1.8 ~ 2.0 mL的 1, 3-二氨基丙烷在室温下搅拌过夜，最后用水和乙醇分别洗涤后干燥得到氨基化氧化石墨烯；（3）取5 ~ 15 mg氨基化氧化石墨烯分散在5 ~ 15 mL盐酸溶液中，经过超声波处理15~ 45 min，将其分散均匀，悬浊液放在冰浴中冷却至0 °C，然后将0.4 ~ 0.6 mL苯胺加入到氨基化氧化石墨烯中继续搅拌，并缓慢加入5 ~ 15 mL溶有1.25 ~ 1.45 g过硫酸钾的溶液，该反应在冰浴中持续4 ~ 6 h后，加入浓度为0.1 mol/L的盐酸溶液去除所有未反应的反应物，用去离子水和己烷各洗涤3次后，干燥12 h，得到石墨烯/聚苯胺溶液；（4）将1 ~ 3 mL、浓度为2 mg/mL的石墨烯/聚苯胺溶液与1 ~ 3 mL的钯纳米粒子溶液混合，避光振荡24 ~ 48 h，离心分离弃去上清液，分散到1 mL超纯水中，制得钯杂化石墨烯/聚苯胺溶液，随后加入50 ~ 150 uL、浓度为1 ug/mL的捕获抗体Ab1溶液振荡6 ~ 18 h后，经过离心分离后分散到 2 mL、pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液中，得到捕获抗体Ab1标记的钯杂化石墨烯/聚苯胺溶液。 3.如权利要求1所述的一种石墨烯/聚苯胺纳米线阵列免疫传感器的制备方法及应用，所述检测抗体Ab2标记的铈掺杂二硫化锡-鲁米诺溶液，其特征在于，制备步骤如下：（1）将浓度为0.01 ~ 0.03 mol/L 五水合四氯化锡、浓度为0.001 ~ 0.003 mol/L六水合硝酸铈，0.05 ~ 0.07 mol/L 硫代乙酰胺，0.4 ~ 0.6 g 溴化十六烷基三甲铵完全溶解于乙醇和蒸馏水的混合物，将混合物转移至200 mL聚四氟乙烯内衬的高温反应釜中，温度保持在180 °C，反应24 ~ 48 h，随后冷却至室温；所得到的固体离心洗涤多次后，在60 °C的真空干燥箱中干燥12 ~ 36 h，然后在500 °C，氩气保护下烧结2 ~ 4 h，得到铈掺杂二硫化锡固体; （2）称取1 ~ 3 mg的铈掺杂二硫化锡分散到0.5 ~ 1.5 mL去离子水中，配成溶液，紧接着加入5 ~ 15 μL、浓度为5 mmol/L鲁米诺，振荡6 ~ 18 h后，通过离心分离获得沉淀物，最终，将其重新分散到1 mL去离子水中，得到的目标溶液铈掺杂二硫化锡-鲁米诺溶液；（3）在上述溶液中，加入100 ~ 300 μL、浓度为10 mg/mL的检测抗体Ab2溶液，在4 °C下振荡孵化6 ~ 18 h，离心后分散到1 mL pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液中得到检测抗体Ab2标记的铈掺杂二硫化锡-鲁米诺溶液，置于4 °C下储存备用。 4.如权利要求1所述的制备方法制备的电致化学发光传感器用于检测降钙素原的应用。 5.如权利要求4所述的用于检测降钙素原的应用，其特征在于，步骤如下：（1）参数设置：超微弱电致化学发光仪的光电倍增管高压设置为800 V，电化学工作站循环伏安扫描电位范围设置为0 ~ 0.7 V，扫描速率设置为0.1 V/s；（2）测试：以银/氯化银电极作为参比电极，铂丝电极为对电极，以权利要求1制备的传感器为工作电极，将孵化一系列标准浓度降钙素原的传感器浸入10 mL含35 ~ 65 mmol/L过氧化氢的磷酸盐缓冲溶液中进行电致化学发光测试，得到孵化不同浓度降钙素原时对应的电致化学发光信号强度，绘制工作曲线，其检出限为1.2 fg/mL，线性范围为5 fg/mL -50 ng/mL；（3）将孵化未知浓度的降钙素原实际样品的电致化学发光传感器进行测试得到相应的信号强度，据此根据工作曲线计算得到该试剂样品中的降钙素原浓度。
所属类别：	发明专利