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原文传递一种游离雌三醇（fE3）检测试剂盒及其制备方法与应用

专利名称：	一种游离雌三醇（fE3）检测试剂盒及其制备方法与应用
摘要：	本发明公开了一种游离雌三醇(fE3)检测试剂盒及其制备方法与应用，所述试剂盒包括以下试剂组分：校准品、质控品、抗试剂A、抗试剂B、磁微粒试剂和发光底物；本发明的试剂盒性能可靠、灵敏度高、线性范围宽，可配合半自动、全自动仪器使用；提高检测灵敏度及可靠性，并降低成本，延长有效期。本发明以碱性磷酸酶(AP)为标记酶，通过化学反应标记fE3抗原衍生物，并使用凝胶层析分离未反应的酶或抗原衍生物，提高反应的灵敏度；以免疫磁微粒为固相载体，以羊抗异硫氰酸荧光素抗体偶联磁性微球，作为通用的分离试剂，不仅使免疫反应更容易混匀和分离，而且大大提高了反应速度。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	江苏;32
申请人：	江苏泽成生物技术有限公司
发明人：	刘振华;刘振世;曾云;于晨
专利状态：	有效
申请日期：	2019-06-04T00:00:00+0800
发布日期：	2019-09-17T00:00:00+0800
申请号：	CN201910483367.6
公开号：	CN110244040A
代理机构：	北京联瑞联丰知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：	黄冠华
分类号：	G01N33/535(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	214000 江苏省无锡市江阴市东盛西路6号(扬子江生物医药加速器A4-1)
主权项：	1.一种游离雌三醇(fE3)检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括以下试剂组分：校准品、质控品、抗试剂A、抗试剂B、磁微粒试剂和发光底物；所述校准品和质控品是用含蛋白的缓冲液溶解fE3抗原后稀释至含去皮质醇人血清的缓冲液中配制得到；所述抗试剂A是碱性磷酸酶标记的fE3抗原衍生物；所述抗试剂B是异硫氰酸荧光素标记的fE3单克隆抗体；所述磁微粒试剂是由抗异硫氰酸荧光素抗体与磁微粒偶联制得；所述发光底物为碱性磷酸酶体系的底物液。 2.根据权利要求1所述的游离雌三醇(fE3)检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括清洗液。 3.一种如权利要求1或2所述的游离雌三醇(fE3)检测试剂盒的制备方法，其特征在于：包括如下步骤： (a)制备所述校准品和质控品：采用含蛋白的缓冲液溶解fE3抗原后稀释至含去皮质醇人血清的缓冲液中，稀释成不同浓度点，通过定标得到； (b)制备所述抗试剂A：将碱性磷酸酶标记的fE3抗原衍生物按照一定浓度加入到Tris盐缓冲液中制得，具体包括如下步骤： (b-1)碱性磷酸酶与fE3抗原衍生物的偶联： (b-1-1)取适量fE3抗原衍生物用DMSO：Dioxane＝1:1溶解至4-6mg/ml，充分混匀，得到第一混合物； (b-1-2)向所述第一混合物中加入一定比例的氯甲酸乙酯(ECF)和三乙基胺(TEA)36-38℃水浴20-40min，得到第二混合物； (b-1-3)将碱性磷酸酶用0.025M硼酸盐缓冲液配制浓度为1.0-5.0mg/mL，进行稀释，使用分光光度计在280nm处读取吸光值，使得吸光值乘以稀释倍数所得的浓度值与配制目标浓度偏差小于10％，得到第三混合物； (b-1-4)取所述第二混合物和第三混合物，按所述fE3抗原衍生物和碱性磷酸酶摩尔比为20:1～40:1的量转移到棕色玻璃瓶内，室温下搅拌4-5小时，得到所需的碱性磷酸酶与fE3抗原衍生物的偶联物； (b-2)所述碱性磷酸酶与fE3抗原衍生物的偶联物的纯化：使用pH＝7-9的Tris盐缓冲液对G25色谱柱进行平衡，使用pH＝7-9的Tris盐缓冲液进行洗脱，紫外监测，分部收集洗脱液，记录仪记录纯化图谱，确认含有所述碱性磷酸酶与fE3抗原衍生物的偶联物的试管，注意、避光防护，用紫外分光光度计测试其浓度； (b-3)将所述纯化后的碱性磷酸酶与fE3抗原衍生物的偶联物按照一定比例加入到含表面活性剂的Tris盐缓冲液中制得抗试剂A； (c)制备所述抗试剂B：将异硫氰酸荧光素标记的fE3单克隆抗体按照一定浓度加入到Tris盐缓冲液中制得，具体包括如下步骤： (c-1)异硫氰酸荧光素与fE3单克隆抗体的偶联： (c-1-1)将异硫氰酸荧光素用pH＝8-9的碳酸氢盐缓冲液配制成浓度为0.4-0.8mg/mL，对异硫氰酸荧光素进行10倍稀释，使用分光光度计在495nm处读取吸光值，使得吸光值控制在0.92-1.08范围内，得到第四混合物； (c-1-2)将fE3单克隆抗体用pH＝8-9的碳酸氢盐缓冲液更换保存液并转移到棕色玻璃瓶内保存，得到第五混合物； (c-1-3)按所述fE3单克隆抗体体积量：异硫氰酸荧光素体积量为5:1-20:1计算所需要的异硫氰酸荧光素的体积，取所述第四混合物加入到第五混合物中，室温下搅拌10-12小时，反应过程严格避光，得到异硫氰酸荧光素与fE3单克隆抗体偶联物； (c-2)所述异硫氰酸荧光素与fE3单克隆抗体偶联物的纯化：使用pH＝8-9的碳酸氢盐缓冲液对G25色谱柱进行平衡，使用pH＝8-9的碳酸氢盐缓冲液进行洗脱，收集第一个有颜色的洗脱峰，注意避光防护，用紫外分光光度计测试其蛋白浓度及FITC浓度，并计算其F/P，F/P要在1.5-9范围内才可判定为合格； (c-3)将得到的所述异硫氰酸荧光素与fE3单克隆抗体偶联物按照一定比例加入到含表面活性剂的Tris盐缓冲液中制得抗试剂B； (d)制备所述磁微粒试剂：将羊抗异硫氰酸荧光素抗体与磁微粒偶联制得，通过羊抗异硫氰酸荧光素抗体与所述异硫氰酸荧光素的特异性结合使抗原抗体免疫复合物固定在磁微粒上，具体包括如下步骤： (d-1)将羧基磁珠浓缩液充分混匀，在充分混匀后取出羧基磁珠浓缩液至反应瓶中，将反应容器置于磁场12-18min，待羧基磁珠全部沉降后吸去上清液； (d-2)清洗羧基磁珠：加入羧基磁珠体积2-5倍的MES缓冲液，混匀20-30min，再置于磁场中待所述羧基磁珠全部沉降12-18min后吸去上清液； (d-3)重复所述清洗步骤(d-2)若干遍，充分清洗所述羧基磁珠后将羧基磁珠溶液定容到10-50mg/mL，持续混匀； (d-4)连接反应：按照羧基磁珠：羊抗异硫氰酸荧光素抗体质量比为100:1～50:1的量在所述步骤(d-3)的羧基磁珠溶液中加入用保存在MES缓冲液体系中羊抗异硫氰酸荧光素抗体，保持混匀状态下2～8℃反应16-20小时； (d-5)使用磁珠封闭剂对所述步骤(d-4)中的羧基磁珠表面裸露的羧基进行封闭3-8小时，得到免疫磁珠； (d-6)用磁珠缓冲液将得到的所述免疫磁珠清洗若干遍后定容至8-12mg/mL，2～8℃保存待用； (d-7)用磁珠缓冲液将所述步骤(d-6)中的定容后的免疫磁珠稀释至一定浓度，制得磁微粒试剂； (e)将制备得到的所述校准品、质控品、抗试剂A、抗试剂B和磁微粒试剂及市售的碱性磷酸酶体系的底物液独立地置于包装容器内，即得到所需的游离雌三醇(fE3)检测试剂盒。 4.根据权利要求3所述的游离雌三醇(fE3)检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述步骤(a)中的含去皮质醇人血清的缓冲液内添加有防腐剂，并使用0.22μm滤膜过滤处理后得到。 5.根据权利要求4所述的游离雌三醇(fE3)检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述防腐剂为：四环素和硫酸新霉素，其中所述四环素的用量为所述去皮质醇人血清缓冲液质量分数的0.01％-0.05％；所述硫酸新霉素的用量为所述去皮质醇人血清缓冲液质量分数的0.1-0.5％。 6.根据权利要求3所述的游离雌三醇(fE3)检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述步骤(b)和步骤(c)中的Tris盐缓冲液是由0.1-0.4mM Tris盐，0.02％-0.05％体积百分数的四环素、1％-5％体积百分数的绵羊血清、3％-10％体积百分数的新生牛血清、1％-5％体积百分数的马血清配制而成。 7.根据权利要求3所述的游离雌三醇(fE3)检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述步骤(b)或步骤(c)中的表面活性剂为Tween 20、Triton X-100或Bronidox中的至少一种。 8.一种如权利要求1或2所述的游离雌三醇(fE3)检测试剂盒的使用方法，其特征在于：使用所述试剂盒定量检测fE3，具体包括如下步骤： (A)向三根试管内分别加入50-70μL所述校准品、质控品和待测样本； (B)向所述步骤(A)中的三根试管内分别再加入20-40μL所述抗试剂A； (C)向所述步骤(B)中的三根试管内分别再加入20-40μL所述抗试剂B； (D)用塑料薄膜分别覆盖所述步骤(C)的三根试管，使用多管混匀器轻度振荡20-40s后，置于36-38℃水浴10-20分钟； (E)向所述步骤(D)中的三根试管内分别再加入20-40μL所述磁微粒试剂； (F)用塑料薄膜分别覆盖所述步骤(E)的三根试管，使用多管混匀器轻度振荡20-40s后，置于36-38℃水浴1-10分钟； (G)将所述步骤(F)中的三根试管放置在磁分离器上，确保每根试管都与分离器表面接触，沉淀1-3分钟；缓慢的倒转所述磁分离器，倒出试管内的上清液，把倒转的试管连同分离器一起放在滤纸上，用力拍击所述磁分离器底部以除去粘在所述管壁上的所有液滴； (H)向所述步骤(G)中的三根试管内加入200-400μL清洗液，用塑料薄膜覆盖所述三根试管，使用多管混匀器轻度振荡20-40s，至彻底混匀，操作3次； (I)把所述步骤(H)中的三根试管从所述磁分离器上取下，再分别加入100-200μL所述发光底物，振荡混匀2-4s，用化学发光仪检测发光强度。
所属类别：	发明专利