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原文传递一种检测雌激素受体的电化学传感器及其应用

专利名称：	一种检测雌激素受体的电化学传感器及其应用
摘要：	本发明公开了一种基于3’‑平末端DNA Y‑结构的电化学传感器及其检测方法来检测雌激素受体(ER)，在ER存在的情况下，它能与修饰在电极表面的DNA Y‑结构中的双链DNA特异性结合，使DNA免受外切酶III的降解。由于DNA Y‑结中含有G‑四联体，在电极表面加入血红素后形成具有辣根过氧化物酶样活性的DNA模拟酶，产生明显的电化学信号，从而实现了ER的定量检测。本发明能在0.1～200nm范围内检测到ER，检测限(LOD)为0.034nm。本发明可用于肿瘤细胞内ER的检测，在临床应用中有着重要的前景。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	江苏;32
申请人：	南京市第二医院
发明人：	李金龙;张永臣;胡亮;许传军;胡凯;张兆利
专利状态：	有效
申请日期：	2019-06-13T00:00:00+0800
发布日期：	2019-09-17T00:00:00+0800
申请号：	CN201910510316.8
公开号：	CN110243906A
代理机构：	南京瑞弘专利商标事务所(普通合伙)
代理人：	冯慧
分类号：	G01N27/327(2006.01);G;G01;G01N;G01N27
申请人地址：	210003 江苏省南京市钟阜路1号—1
主权项：	1.一种检测雌激素受体的电化学传感器，其特征在于:该检测器基于3’-平末端DNA Y-结构，在ER存在下，它能与修饰在电极表面的DNA Y-结构中的DNA特异性结合，使DNA不受外切酶III降解的影响，由于DNA Y-结中含有G-四联体，在电极上加入血红素后，形成具有辣根过氧化物酶样活性的DNA模拟酶，会产生明显的电化学信号，从而实现了ER的定量检测。 2.一种如权利要求1所述的电化学传感器的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤： (1)金电极预处理； (2)将5-20μL含有0.2μm P1的DNA固定液滴定在预处理的金电极表面，在4℃条件下，孵育8-16小时，P1通过Au-S键组装在电极表面； (3)金电极进一步用1mM MCH溶液处理10-50分钟，然后用DNA杂交缓冲液冲洗； (4)在37℃下，将含有1μm P3(信号探针)和1μm P2的DNA杂交缓冲液滴加在金电极表面1-3h，杂交后，用去离子水彻底冲洗电极，即可制得电化学传感器。 3.如权利要求2所述的电化学传感器的制备方法，步骤(1)金电极预处理，具体包括如下步骤： a)金电极用氧化铝粉末抛光，得到抛光后的电极； b)将步骤a)中抛光后的电极浸泡在水虎鱼溶液中2-20min消除吸附的有机物，并用去离子水彻底清洗； c)再将电极用50％硝酸浸泡10-30min，然后分别用乙醇和去离子水处理电极2-8min，再用氮气吹干后，将电极浸入0.5M硫酸中，用循环伏安法(CV)从0到1.6V进行扫描直到获得稳定的信号。 4.如权利要求2所述的电化学传感器的制备方法，其特征在于：步骤(2)中DNA固定液的用量为10μL；步骤(3)中的处理金电极的时间为30分钟；步骤(4)DNA杂交缓冲液中P3和P2的浓度比为1：1；步骤(4)中DNA杂交缓冲液的用量为10μL。 5.如权利要求3所述的电化学传感器的制备方法，步骤b)中的水虎鱼溶液具体为[V(H2SO4)：(30％H2O2)＝3：1]。 6.如权利要求1所述的电化学传感器及权利要求2所述的电化学传感器的制备方法在检测雌激素受体方面的应用，具体步骤如下： (1)将DNA Y结构修饰的金电极浸入含有ER的50-300μL DNA结合缓冲液中37℃浸泡50-100分钟； (2)用PBS对电极进行彻底冲洗，并浸入30-80μl含有2U外切酶III的NEB缓冲液I中，37℃孵育10-50分钟，然后，加入20mmEDTA以终止外切酶III反应后，用PBS缓冲液和去离子水对电极进行冲洗； (3)在室温下将10μl新制备的含25mM HEPEs、100μm Hemin、200mM NaCl、12.5mM MgCl2和50mM KCl的Hemin溶液滴到电极表面0.5-2h，随后，使用电极进行测量； (4)电化学检测：电化学阻抗谱(EIS)在5.0m M的[Fe(CN)6]3-/4-含KCl(0.1M)中进行，频率在10-1至105Hz范围内，在含有1.0mM H2O2和0.2mM HQ的5ml PBS(0.1M，PH7.4)中进行差分脉冲伏安法(DPV)，扫描范围为-0.2至0.2v。 7.如权利要求6中的应用，其特征在于：步骤(1)中DNA结合缓冲液的体积为150μL；步骤(1)中浸泡时间为30分钟；步骤(2)中，NEB缓冲液I的体积为50μl。
所属类别：	发明专利