详情

原文传递 ATP生物荧光lgCB-lgIB标曲法评价液体消毒剂真菌杀灭效果的方法

专利名称：	ATP生物荧光lgCB-lgIB标曲法评价液体消毒剂真菌杀灭效果的方法
摘要：	本发明涉及一种液体消毒剂真菌杀灭效果评价方法，评价步骤包括：样品提取及最低有效浓度确定；设备选型及试剂、培养基配制；菌种保藏、活化及菌悬液制备；美蓝染色后菌悬液活菌含量CB血球板计数及接种菌液CB标定；lgCB‑相对荧光强度对数值lgIB标曲建立；中和剂鉴定及定量悬液试验；回收液IB测定及其活菌含量CB和TB推算；杀灭率R及灭菌指数A计算；结果判定；其特别之处在于：应用ATP荧光光度计对以R或A表征的消毒剂真菌杀灭效果进行精准定量评价。本发明规定回收作用不同时间后的试验样液和对照样液，测定其IB并以lgIB表征和计算R或A；提供结果判定依据。本发明研发的消毒剂真菌杀灭效果评价的ATP生物荧光lgCB‑lgIB标曲法，可完善相关消毒效果评价方法体系。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	河北;13
申请人：	李文杰
发明人：	李文杰;闫冀焕;崔宗岩;钱云开;郝凌云
专利状态：	有效
申请日期：	2019-03-15T00:00:00+0800
发布日期：	2019-09-24T00:00:00+0800
申请号：	CN201910200132.1
公开号：	CN110274896A
分类号：	G01N21/64(2006.01);G;G01;G01N;G01N21
申请人地址：	050000 河北省唐山市路北区祥云西里17楼3门202号
主权项：	1.一种液体消毒剂真菌杀灭效果的评价方法，包括：(1)样品提取及最低有效浓度确定；(2)设备选型及试剂、培养基配制；(3)菌种保藏、活化及菌悬液制备；(4)美蓝染色后菌悬液活菌含量CB的血球板计数及接种菌液CB标定；(5)活菌含量对数值lgCB-相对荧光强度对数值lgIB标准曲线建立；(6)中和剂鉴定及定量悬液试验；(7)回收液相对荧光强度值IB测定；(8)回收液活菌含量CB和TB推算及杀菌率R和灭菌指数A计算；(9)结果判定；其特征在于，应用ATP荧光光度计对以杀灭率R或灭菌指数A表征的液体消毒剂真菌杀灭效果进行精准定量评价的ATP生物荧光lgCB-lgIB标准曲线法，具体的：在回收液相对荧光强度值IB测定中：明确样品提取要求，确定消毒剂10min内抑杀指示菌的最低有效浓度，将真菌试验菌种的标准菌株进行传代、活化后，取新鲜白色念珠菌或霉菌孢子培养物制备菌悬液；经美蓝染色后采用血球计数板测定菌液的活菌含量CB，并对接种菌液CB进行标定：5.0×106CFU/mL～9.0×106CFU/mL，选择活菌含量CB为3.5×103CFU/mL、3.5×104CFU/mL、3.5×105CFU/mL的菌液作为标准系列菌悬液，应用ATP荧光光度计对其相对荧光强度值IB进行测定；绘制lgCB-lgIB标准曲线，推导得出曲线的线性方程式Y＝aBX+bB及相关系数RB2，然后，以待测消毒剂的最低有效浓度进行中和剂鉴定试验，确定中和剂种类及浓度；同时将4.41mL各浓度的试验样液和对照样液置于(20±2)℃水浴中并使其与0.49mL接种菌液混合；待灭菌作用持续t1、t2、t3、t4四段不同时间后，将0.49mL染菌样液分别与4.41mL中和剂溶液混合，中和作用进行10min后将其混匀液作为回收液；应用ATP荧光光度计测定回收液的相对荧光强度值和并根据指示菌种标准曲线方程式Y＝aBX+bB推算相应的活菌含量和在杀灭率R或灭菌指数A计算中：根据指示菌种标准曲线lgCB-lgIB的线性方程式Y＝aBX+bB，针对t1、t2、t3、t4四段不同灭菌时间，以每次定量悬液试验中各浓度试验样液及对照样液回收活菌的相对荧光强度测定值作为基础数据；计算其对真菌的杀灭率或灭菌指数并取其五次试验的算术平均值作为相应浓度待测液体消毒剂样品在相同灭菌时间内对真菌的杀灭率或灭菌指数同时明确相关数据修约和测量不确定度要求；在结果判定中：参考卫生行业通用做法和相关消毒效果生物学评价标准，如果某浓度待测液体消毒剂样液在单次定量悬液试验中，经ATP生物荧光lgCB─lgIB标准曲线法测得的特定灭菌时间内的真菌杀灭率≥99.9％或灭菌指数≥3.0，则判定其在此次试验中消毒效果合格，当该浓度待测液体消毒剂样液在5次定量悬液试验中相同灭菌时间内的消毒效果均合格时，方可确定其对真菌具有消毒效果的最低浓度和最短时间(在实际应用中以有机物保护试验的最低浓度和最短时间为待测液体消毒剂样品达到实用消毒效果所需的浓度和时间)。 2.根据权利要求1所述的液体消毒剂真菌杀灭效果的评价方法，其特征在于，所述的样品提取及最低有效浓度确定，按下述步骤进行： (1)对照样品：以察氏培养液作为对照样品； (2)试验样品：从某生产批号1个完整运输包装中随机抽取1件最小销售包装的液体消毒剂样品，用于中和剂鉴定和定量悬液试验；每组试验样品选择一组对照样品作为参照物并有效标识； (3)消毒剂样品最低有效浓度的确定：按照待测消毒剂样品使用说明书标注的有效浓度范围，将其用无菌水稀释为高、中、低三个适宜浓度；用灭菌移液枪将4.41mL不同浓度的稀释液分装三支无菌试管，并向各试管中分别滴加0.49mL接种菌液；3000r/min振摇试管30s后，将其置于(20±2)℃水浴中，待试管内溶液温度与水浴温度平衡后开始计时，使消毒剂对真菌的杀灭作用持续10min；然后，以其混匀液作为回收液，按照本专利中相对荧光强度值IB测定方法，测定并记录回收液的相对荧光强度值，同时，以4.41mL察氏培养液作为对照样品重复上述杀菌试验及回收液IB测定过程；并依据本专利中杀灭率R计算公式，对不同浓度稀释液的杀灭率进行计算；若某浓度杀灭率R为99.9％，则将此浓度设定为待测消毒剂样品的最低有效浓度。 3.根据权利要求1所述的液体消毒剂真菌杀灭效果的评价方法，其特征在于，所述的设备选型及试剂、培养基配制，按下述步骤进行： (1)通用要求：试验用分析纯试剂及符合GB/T 6682-2008规定的三级水(蒸馏水或去离子水)，实验室具备二级生物安全资质，人员具有正规微生物实验室工作经验； (2)仪器设备：二级生物安全柜或洁净等级不低于100的超净工作台；含ATP荧光光度计、专用试管等的ATP生物荧光快速检测系统，ATP荧光光度计波长量程300nm～650nm，真菌细胞/孢子总数检测范围101CFU/mL～106CFU/mL；放大倍数40×～400×的生物光学显微镜；(25～37)℃±1℃的恒温培养箱；(10～50)℃±1℃的恒温水浴箱；(0～50)℃±1℃、(50～300)r/min的恒温振荡器；转速≥8000r/min的离心机及配套离心管；转速范围(500～3000)r/min的旋涡振荡器；(121±2)℃、(103±5)kPa的压力蒸汽灭菌器；-20℃～-80℃的低温冰箱；0℃～10℃的冷藏箱；感量0.001g的电子天平；频率范围(30～50)kHz的超声波清洗器；精度±0.1(25℃)的pH计；电炉； (3)材料器具：血球计数板及专用盖玻片；1mL、10mL的无菌刻度吸管；0.05mL、0.1mL、0.2mL、1mL、5mL、10mL(计量误差小于1％)的单道可变量程移液枪和无菌移液枪头；容量100mL、250mL、500mL的无菌锥形瓶及瓶塞；无菌培养皿；玻璃漏斗；无菌旋塞试管；直径不大于4mm的接种环；直径5mm的玻璃珠；酒精灯；灭菌镊子；用于生化检测的药棉和纱布；无菌滤纸；的温度计；精度0.01s的秒表； (4)试剂：0.1％的吕氏碱性美蓝染色液；小牛血清；以下试剂121℃高压灭菌30min，5℃～10℃存放30d：85％的生理盐水；N一甲基乙磺酸、吐温80、二辛磺化丁二酸钠任选一种，配制成0.05％的润湿剂水溶液；将5g硫代硫酸钠溶于1000mL水(用于氯型消毒剂)；将1.36g磷酸二氢钾、2.83g磷酸氢二钠、10g卵磷脂、10g甘氨酸、30g吐温(80)溶于1000mL水或将1.36g磷酸二氢钾、2.83g磷酸氢二钠、3g卵磷脂、20g吐温(80)溶于1000mL水(用于非氧化型消毒剂)；将20g吐温(80)、1g硫代硫酸钠溶于1000mL磷酸盐缓冲溶液(用于氧型消毒剂)等(或针对待测液体消毒剂样品类型，选择其它相适用的中和剂)； (5)培养基/液(可用市售培养基/液)：所配培养基/液分装后121℃高压灭菌30min，2℃～8℃存放30d；沙氏培养基/液(白色念珠菌菌种活化用)：将40g葡萄糖、10g蛋白胨、20g琼脂加热溶解于1000mL水中(培养液不加琼脂)，调节pH至5.6±0.2(25℃)；察氏培养液(霉菌孢子液制备、菌悬液稀释及样品洗脱用)：将2g硝酸钠、1g磷酸氢二钾、0.5g氯化钾、0.5g硫酸镁、0.01g硫酸亚铁、30g蔗糖加热溶解于1000mL含0.05％润湿剂的水溶液中，调节pH至6.0～6.5(25℃)；马铃薯一葡萄糖培养基(霉菌孢子菌种活化用):将300g新鲜马铃薯去皮切块，在1000mL水中煮沸20min～30min；过滤取汁，向滤液中加入20g葡萄糖、0.1g氯霉素、20g琼脂后定容至1000mL； (6)ATP荧光反应试剂(或用市售试剂)：除磷酸盐缓冲溶液外，所配ATP荧光反应试剂-20℃～-70℃保存，6个月内使用；稀释缓冲溶液：0.005mol/L且含0.037％蔗糖的磷酸氢二钠溶液，调节pH至7.2±0.2；121℃高压灭菌15min，2℃～8℃存放30d； ATP荧光试剂缓冲溶液：将1117mg三羟甲基氨基甲烷、183mg乙二胺四乙酸二钠、808mg乙酸镁、6.7mg二巯基苏糖醇、25000mg的β-环糊精和925mg葡萄糖加热溶解于250mL水中，调节pH至7.5±0.2；8h内使用； ATP裂解液：将4.6国际单位/ml的三磷酸腺苷双磷酸酶(EC:3.6.1.5)和46国际单位/ml的磷酸腺苷脱氨酶(EC:3.5.4.6或EC:3.5.4.17)、37mg蔗糖、20mg牛血清蛋白溶解于10mL浓度为0.05mol/L的2-吗啉乙磺酸缓冲溶液中，调节pH至6.0±0.5，8h内使用(1mL裂解液在15min内可将沙氏培养液中的ATP浓度降至10-11mol/L以下)； ATP提取液：将45mg三羟甲基氨基甲烷加热溶解于9.8ml水中，与0.2ml浓度为10％的苯扎氯铵溶液混匀后，调节pH至12.0±0.5(真菌细胞ATP提取效率不低于80％)； ATP荧光试剂：将0.7mg荧光素酶、12.6mg的D-荧光素、56mg牛血清蛋白溶解于30mL的ATP荧光试剂缓冲溶液，混匀后室温静置15min，3h内使用。 4.根据权利要求1所述的液体消毒剂真菌杀灭效果的评价方法，其特征在于，所述的菌种保藏、活化及菌悬液制备，按下述步骤进行： (1)指示菌种：白色念珠菌ATCC 10231；黑曲霉ATCC 16404；球毛壳霉ATCC 6205；产黄青霉ATCC 9179(或由国家微生物菌种保藏中心提供并可溯源的其他菌种)； (2)菌种保藏：白色念珠菌——以无菌操作打开冻干菌种管，用毛细吸管向管内注入适量沙氏培养液，吹吸数次使菌种融化分散；将少许菌种悬液滴入装有5mL～10mL沙氏培养液的试管中，37℃培养18h～24h，霉菌——以无菌操作将霉菌试验菌种接种于马铃薯—葡萄糖培养基斜面并标明接种日期，28℃～30℃培养至斜面长满霉菌孢子(7d～14d)；3℃～10℃保藏4个月，作为保藏菌； (3)菌种活化：白色念珠菌——用接种环刮取第1代培养物中的典型菌落，划线接种于沙氏培养基平板；37℃培养18h～24h后，挑取第2代培养物中的典型菌落接种于沙氏培养基斜面；37℃培养18h～24h后，4℃密封存放，6周内使用，霉菌——用接种环刮取保藏菌孢子，接种马铃薯—葡萄糖培养基斜面，28℃～30℃培养7d～14d，直至生成大量孢子，制备孢子悬浮液前不得拔出霉菌菌种的试管塞，每支试管打开后只供制备一次孢子液，每次均使用新培养的霉菌孢子制备悬液； (4)菌悬液制备：白色念珠菌试验——用接种环从斜面上挑取新鲜菌种培养物接种于装有50mL沙氏培养液的无菌锥形瓶中，置于(30±1)℃的恒温振荡器内150r/min培养18h～24h，4℃密封存放，当天使用，霉菌试验——向菌种试管中加入10mL的无菌水，用接种环轻刮培养基表面的新鲜霉菌孢子，将洗出的孢子原液注入装有15粒玻璃珠和45mL察氏培养液的无菌加塞锥形瓶中，3000r/min振摇试管2min，打散孢子团，混匀孢子液，然后，将覆有无菌药棉或八层纱布的玻璃漏斗置于锥形瓶上，过滤孢子悬浮液除去菌丝和培养基碎片；将滤液移至灭菌离心管中，室温下8000r/min分离处理至少10min，去上清液；再用50mL察氏培养液清洗孢子沉淀物并离心，重复清洗3次后，用察氏培养液稀释离心后的孢子沉淀物，每种试验霉菌均按照上述方法制备孢子悬液，并将各菌种的孢子液等体积混合；0℃～7℃存放，当天或4d内使用。 5.根据权利要求1所述的液体消毒剂真菌杀灭效果的评价方法，其特征在于，所述的美蓝染色后菌悬液活菌含量CB血球板计数及接种菌液CB标定，按下述步骤进行： (1)美蓝染色：以无菌操作将50μL稀释度为10-2～10-3的白色念珠菌悬浮液或霉菌混合孢子液和30μL浓度为0.05％的吕氏碱性美蓝染色液分别移至同一支无菌试管中(菌液稀释度以血球计数板每个小方格内含4～5个白色念珠菌细胞或霉菌孢子为宜)，1000r/min振摇试管1min，使菌悬液与染色液充分混匀； (2)血球板计数：用无菌吸管将5μL±0.5μL染色后的菌悬液置于盖玻片边缘，使其沿玻片间隙缓慢渗入血球计数板，计数板与玻片之间不可产生气泡，否则重新操作，用无菌滤纸吸净槽中多余菌液，静置2min±20s，使其全部沉降至计数室内，当使用16中格计数板时,在对角线方位取左上、右上、左下、右下4个中格(即100个小方格)内的白色念珠菌细胞或霉菌孢子进行计数；如使用25中格计数板,除计数上述4个对角方位外,还需计数中央的1个中格(即80个小方格)；当试验菌种位于中格的双线上时，则只计数上线和右线或下线和左线上的白色念珠菌细胞或霉菌孢子； (3)活菌含量CB计算：将生物光学显微镜放大倍数自低向高调至400×后，立即对血球计数板相应空间位置处的白色念珠菌细胞或霉菌孢子进行计数；其中无色的白色念珠菌细胞为活菌，蓝色或淡蓝色者为死菌；边缘呈深蓝色、内部呈无色或淡蓝色及淡红色的霉菌孢子为活菌，边缘与内部均呈深蓝色者为死菌，故只计数边缘与内部颜色不同的孢子，若霉菌孢子悬液中无菌丝单孢子的数量低于90％，则重新制备孢子液，对血球计数板每个小方格中的白色念珠菌细胞或霉菌孢子重复镜检计数三次，取平均值，当血球计数板规格为16×25时，1mL菌液的活菌含量(菌落形成单位每毫升，CFU/mL)CB＝N÷5×16×K×104；当血球计数板规格为25×16时，CB＝N÷5×25×K×104；其中N为血球计数板五个中格内白色念珠菌细胞或霉菌孢子的活菌总数，K为菌液稀释倍数，然后，用察氏培养液对已知活菌含量CB的白色念珠菌悬浮液或霉菌混合孢子液进行稀释，得到CB范围为5.0×106CFU/mL～9.0×106CFU/mL的接种菌液。 6.根据权利要求1所述的液体消毒剂真菌杀灭效果的评价方法，其特征在于，所述的活菌含量对数值lgCB-相对荧光强度对数值lgIB标准曲线建立，按下述步骤进行：用察氏培养液对已知活菌含量CB的白色念珠菌悬浮液或霉菌混合孢子液进行连续梯度稀释后，得到标准系列菌悬液：3.5×103CFU/mL、3.5×104CFU/mL、3.5×105CFU/mL并混匀，然后，根据本专利中相对荧光强度值IB测定方法，按照活菌含量CB从低到高的顺序，测定并记录上述标准溶液的相对荧光强度值，然后，以标准系列菌悬液的相对荧光强度对数值lgIB作为横坐标，以相应的活菌含量对数值lgCB为纵坐标作图；对二者之间的数学关系进行曲线标定，应用最小二乘拟合法推导得出曲线方程式Y＝aBX+bB及线性相关系数RB2；当RB2≥0.98、置信水平≥0.95时，按照本专利方法所做的测定有效。 7.根据权利要求1所述的液体消毒剂真菌杀灭效果的评价方法，其特征在于，所述的中和剂鉴定及定量悬液试验，按下述步骤进行： (1)中和剂鉴定试验：选取作用10min抑杀指示菌99.9％的消毒剂最低有效浓度作为中和剂鉴定试验的样液浓度，并将1mL试验样液与9mL中和剂溶液混合；作用10min形成中和产物后，进行试验分组如下：将0.49mL接种菌液(与lgCB-lgIB曲线标定用菌液取自同一支指示菌种原液试管，2℃±0.2℃保存，2h内使用)分装五支含4.41mL试验样液(1#、2#)、4.41mL中和产物溶液(3#)、4.41mL察氏培养液(4#)、4.41mL中和剂溶液(5#)的无菌试管中，1000r/min振摇试管10min，使其溶液充分混匀，然后，用灭菌移液枪将0.49mL各组混匀液分装五支含4.41mL察氏培养液(1#、3#、4#、5#)、4.41mL中和剂溶液(2#)的无菌试管中，同时将另外一支无菌试管中的4.9mL察氏培养液作为第6#组试验样液，1000r/min振摇各组试管10min后，将其混匀液作为试验样液的回收液，按照本专利中相对荧光强度值IB测定方法，测定并记录上述6组回收液的相对荧光强度值； (2)中和效果评价：如果第1#、6#组回收液的相对荧光强度测定值IB1≥0、IB6＝0，第2#～5#组回收液的相对荧光强度测定值之间关系为：IB2＞0且IB2＜IB3、IB2＜IB4、IB2＜IB5；第3#、4#、5#组回收液的相对荧光强度测定值接近，即IB3≈IB4≈IB5，其按照公式(1)计算得到的活菌含量CB3、CB4、CB5组间误差率Δ≤10％；说明所选中和剂种类可用于待测液体消毒剂样品真菌杀灭效果试验，并依据等当量中和原则，调整中和剂浓度后重复上述中和剂鉴定试验，确定消毒剂试验浓度对应的中和剂浓度；式中： Δ—第3#、4#、5#组回收液的活菌含量CB3、CB4、CB5组间误差率，％； IB3、IB4、IB5—第3#、4#、5#组回收液的相对荧光强度测定值，RLU； —第3#、4#、5#组回收液的平均活菌含量，其数值为CFU/mL； aB—标准曲线lgCB-lgIB斜率；bB—标准曲线lgCB-lgIB在纵轴截距； (3)定量悬液试验：按照待测消毒剂使用说明中标注的有效浓度和作用时间范围，用无菌水将其稀释为高、中、低三个适宜浓度：C1、C2、C3(C1为产品说明中规定的最低使用浓度)，其中C2＝2C1、C3＝2C2；同时选取四段不同的灭菌时间t1、t2、t3、t4(t2为产品说明中规定的最短作用时间)，其中t1＝0.5t2、t3＝1.5t2、t4＝2t2，然后，用灭菌移液枪将4.41mL不同浓度的试验样液分装三支无菌试管中；并置于(20±2)℃水浴中，待试管内溶液温度与水浴温度平衡后，分别滴加0.49mL接种菌液，3000r/min振摇试管30s后开始记时，当灭菌作用持续至设定的t1、t2、t3、t4四段不同时间后，用灭菌移液枪将0.49mL不同浓度的混匀液分装三支含4.41mL中和剂溶液的无菌试管中，3000r/min振摇试管30s并开始记时，待中和作用持续10min后，将其混匀液作为各浓度试验样液的回收液，然后，用察氏培养液替代试验样液重复上述试验；试验重复5次；然后，将小牛血清加入菌悬液中，使其最终血清含量为10％并确保接种菌液CB为5.0×106CFU/mL～9.0×106CFU/mL，重复上述定量悬液试验5次；确定待测液体消毒剂样品在有机物存在的条件下，对真菌具备消毒效果的有效浓度和时间。 8.根据权利要求1所述的液体消毒剂真菌杀灭效果的评价方法，其特征在于，所述的回收液相对荧光强度值IB测定，按下述步骤进行： (1)仪器及试剂组相对荧光强度本底值校准：用灭菌移液枪将0.1mL察氏培养液、0.35mL生理盐水和0.05mL的ATP裂解液分别加入同一支无菌试管中，3000r/min振摇试管30s；静置10min～20min，作为一级空白样；再将0.1mL一级空白样移至另外一支无菌试管中，滴加0.4mL生理盐水并混匀，作为二级空白样，然后，用灭菌移液枪将0.1mL二级空白样依次移至三支仪器专用无菌试管中，作为空白测试平行样；向三个平行样中各滴加0.1mL的ATP提取试剂，混匀后滴入0.1mL的ATP荧光试剂，3000r/min振摇试管5s，立即用ATP荧光光度计测定其相对荧光强度值IB并记录(确保各环节操作时间一致，避免交叉污染)，每个平行样测定时间不超过15s，以三个空白测试平行样相对荧光强度值的算术平均值作为仪器和试剂组本底值(或按照仪器使用说明校准本底)； (2)回收液相对荧光强度值IB测定：如空白试剂组本底水平符合仪器使用要求，用灭菌移液枪将4.9mL回收液和0.1mL的ATP裂解液分别加入同一支无菌试管中，3000r/min振摇试管30s；室温静置20min后，滴加5.0mL的ATP提取试剂并再次混匀；室温静置10min，用灭菌移液枪将0.1mL上述混和溶液依次移至三支仪器专用无菌试管中，作为ATP生物荧光测试平行样，向三个平行样中各滴加0.1mL的ATP荧光试剂，3000r/min振摇试管5s，立即用ATP荧光光度计测定其相对荧光强度值IB并记录(确保各环节操作时间一致，避免交叉污染)，每个平行样测定时间不超过15s，以三个ATP生物荧光测试平行样相对荧光强度值的算术平均值作为待测样品回收液的IB测定值。 9.根据权利要求1所述的液体消毒剂真菌杀灭效果的评价方法，其特征在于，所述的回收液活菌含量CB和TB推算以及杀灭率R和灭菌指数A计算，按下述步骤进行： (1)回收液活菌含量CB和TB推算根据指示菌种标曲lgCB-lgIB线性方程式Y＝aBX+bB，推算每次不同浓度的试验样液及对照样液经四段灭/染菌时间后，回收液的活菌含量TB和CB，相关计算见公式(2)～(9)：式中： —每次不同浓度的试验样液经四段灭菌时间后回收的活菌量，单位为菌落形成单位每毫升(CFU/mL)；试验次数i＝1,2,3,4,5；浓度序号j＝1,2,3； —每次不同浓度的试验样液经四段灭菌时间后，回收液的相对荧光强度测定值，RLU；试验次数i＝1,2,3,4,5；浓度序号j＝1,2,3； aB—标准曲线lgCB-lgIB斜率；bB—标准曲线lgCB-lgIB在纵轴截距； —每次不同浓度的对照样液经四段染菌时间后回收的活菌量，单位为菌落形成单位每毫升(CFU/mL)；试验次数i＝1,2,3,4,5；浓度序号j＝1,2,3； —每次不同浓度的对照样液经四段染菌时间后，回收液的相对荧光强度测定值，RLU；试验次数i＝1,2,3,4,5；浓度序号j＝1,2,3； (2)杀灭率R计算在中和剂鉴定结果合格的条件下,每次不同浓度的试验样液在四段灭菌时间内对真菌的杀灭率以及相应浓度的待测液体消毒剂样品在同一灭菌时间内的杀灭率分别按照公式(10)～(17)计算：式中： —每次不同浓度的试验样液在四段灭菌时间内真菌的杀灭率，％；试验次数i＝1,2,3,4,5；浓度序号j＝1,2,3； —相应浓度的待测液体消毒剂样品在四段灭菌时间内对真菌的杀灭率，％；试验次数i＝1,2,3,4,5；浓度序号j＝1,2,3； —每次不同浓度的对照样液经四段染菌时间后回收的活菌量，单位为菌落形成单位每毫升(CFU/mL)；试验次数i＝1,2,3,4,5；浓度序号j＝1,2,3； —每次不同浓度的试验样液经四段灭菌时间后回收的活菌量，单位为菌落形成单位每毫升(CFU/mL)；试验次数i＝1,2,3,4,5；浓度序号j＝1,2,3； —每次不同浓度的试验样液经四段灭菌时间后，回收液的相对荧光强度测定值，RLU；试验次数i＝1,2,3,4,5；浓度序号j＝1,2,3； —每次不同浓度的对照样液经四段染菌时间后，回收液的相对荧光强度测定值，RLU；试验次数i＝1,2,3,4,5；浓度序号j＝1,2,3； aB—标准曲线lgCB-lgIB斜率； (3)灭菌指数A计算在中和剂鉴定结果合格的条件下,每次不同浓度的试验样液在四段灭菌时间内对真菌的灭菌指数以及相应浓度的待测液体消毒剂样品在同一灭菌时间内的灭菌指数分别按照公式(18)～(25)计算：式中： —每次不同浓度的试验样液在四段灭菌时间内对真菌的灭菌指数；试验次数i＝1,2,3,4,5；浓度序号j＝1,2,3； —相应浓度的待测液体消毒剂样品在四段灭菌时间内对真菌的灭菌指数；试验次数i＝1,2,3,4,5；浓度序号j＝1,2,3； —每次不同浓度的对照样液经四段染菌时间后回收的活菌量，单位为菌落形成单位每毫升(CFU/mL)；试验次数i＝1,2,3,4,5；浓度序号j＝1,2,3； —每次不同浓度的试验样液经四段灭菌时间后回收的活菌量，单位为菌落形成单位每毫升(CFU/mL)；试验次数i＝1,2,3,4,5；浓度序号j＝1,2,3； —每次不同浓度的试验样液经四段灭菌时间后，回收液的相对荧光强度测定值，RLU；试验次数i＝1,2,3,4,5；浓度序号j＝1,2,3； —每次不同浓度的对照样液经四段染菌时间后，回收液的相对荧光强度测定值，RLU；试验次数i＝1,2,3,4,5；浓度序号j＝1,2,3； aB—标准曲线lgCB-lgIB斜率； (4)数据修约要求：采用血球计数板标定菌悬液活菌含量CB时，参考GB4789.2—2016中相关规定，当CB小于100CFU/mL时，“四舍五入”取整数；当CB不小于100CFU/mL时，第3位数字“四舍五入”后取前2位数字，后面用0代替位数；也可用10的指数形式表示，“四舍五入”后采用两位有效数字，试验样液及对照样液经四段灭/染菌时间后，回收液的相对荧光强度测定值取整数，对真菌的杀菌率计算结果取三位有效数字，灭菌指数计算结果取两位有效数字； (5)测量不确定度：本专利方法通过计算5次定量悬液试验中不同浓度的试验样液和对照样液经四段不同的灭/染菌时间，回收液15个ATP荧光测试平行样相对荧光强度测定值的变异系数C·V＝σ÷μ×100％(μ、σ和C·V计算结果保留到小数点后两位)；判断将ATP生物荧光分析法应用于液体消毒剂真菌杀灭效果测试的重现性，规定变异系数C·V≤10％，相关计算见公式(26)～(33)：式中： —经t1、t2、t3、t4四段不同灭菌时间后，5次试验中同一浓度的试验样液15个ATP荧光测试平行样的相对荧光强度测定值的算术平均值；试验次数i＝1,2,3,4,5；浓度序号j＝1,2,3；平行样编号k＝1,2,3； —经t1、t2、t3、t4四段不同灭菌时间后，5次试验中同一浓度的试验样液的回收液15个ATP荧光测试平行样相对荧光强度测定值的标准偏差；试验次数i＝1,2,3,4,5；浓度序号j＝1,2,3；平行样编号k＝1,2,3； —经t1、t2、t3、t4四段不同染菌时间后，5次试验中同一浓度的对照样液15个ATP荧光测试平行样的相对荧光强度测定值的算术平均值；试验次数i＝1,2,3,4,5；浓度序号j＝1,2,3；平行样编号k＝1,2,3； —经t1、t2、t3、t4四段不同染菌时间后，5次试验中同一浓度的对照样液的回收液15个ATP荧光测试平行样相对荧光强度测定值的标准偏差；试验次数i＝1,2,3,4,5；浓度序号j＝1,2,3；平行样编号k＝1,2,3。 10.根据权利要求1所述的液体消毒剂真菌杀灭效果的评价方法，其特征在于，所述的结果判定，按下述步骤进行：参考卫生行业通用做法和相关消毒效果生物学评价标准，如果某浓度待测液体消毒剂样液在单次定量悬液试验中，经ATP生物荧光lgCB─lgIB标准曲线法测得的特定灭菌时间内真菌杀灭率≥99.9％或灭菌指数≥3.0，则判定其在此次试验中消毒效果合格，当该浓度待测液体消毒剂样液在5次定量悬液试验中相同灭菌时间内的消毒效果均合格时，方可确定其对真菌具有消毒效果的最低浓度和最短时间(在实际应用中以有机物保护试验的最低浓度和最短时间为待测液体消毒剂样品达到实用消毒效果所需的浓度和时间)。
所属类别：	发明专利