详情

原文传递一种生物样品中代谢标志物检测方法及应用

专利名称：	一种生物样品中代谢标志物检测方法及应用
摘要：	本发明属于代谢组学技术领域，提供一种生物样品中逍遥散代谢标志物及其检测方法和应用，明确逍遥散治疗抑郁症的药理作用机制。所述代谢标志物为4‑羰基2,3烯基己二酸、肌酐、硫胱醚和乙酰磷酸。采用UPLC‑Q‑TOF/MS技术分析逍遥散给药组和对照组病人血浆和代谢轮廓变化，然后采用多元统计分析方法偏最小二乘法判别分析(OPLS‑DA)来筛选逍遥散治疗8周后代谢标志物发生的变化。本研究作为首次逍遥散的临床代谢组学研究，我们发现了逍遥散代谢水平的影响，并在代谢通路层面对它的作用机制做出了初步的阐述，为预测逍遥散治疗抑郁症的药理机制提供新的方法。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	山西;14
申请人：	山西大学
发明人：	秦雪梅;高耀;田俊生;令狐婷;武嫣斐
专利状态：	有效
申请日期：	2019-06-27T00:00:00+0800
发布日期：	2019-09-27T00:00:00+0800
申请号：	CN201910567782.X
公开号：	CN110286191A
代理机构：	太原晋科知识产权代理事务所(特殊普通合伙)
代理人：	翟冲燕
分类号：	G01N30/88(2006.01);G;G01;G01N;G01N30
申请人地址：	030006 山西省太原市坞城路92号
主权项：	1.一种生物样品中逍遥散调节差异代谢标志物，其特征在于：所述代谢标志物为神经酰胺（Stearic amide和 Palmitic amide），肉碱（Carnitine C10:4和Carnitine C14:2）、溶血性磷酸酰胆碱（LPC 10:3、LPC 16:1、 LPC 21:4、 LPC 19:0、LPC 18:0、LPC 23:5和Unknown）、氧化磷酸酰胆碱（PC O 38:0）、植物鞘氨醇（Phytosphingosine）、环己烷十一酸（Cyclohexaneundecanoic acid）、4-羰基2,3烯基己二酸（4-oxo hex-2-ene dioic acid）、肌酐（Creatinine）、硫胱醚（L-Cystathionine）、乙酰磷酸（Acetylphosphate）、4-乙酰氨基丁酸（4-Acetamidobutanoic acid）及十六碳二烯酸（Heptadecadienoic acid）20种。 2.根据权利要求1所述的一种生物样品中逍遥散调节差异代谢标志物，其特征在于：所述代谢标志物为4-羰基2, 3烯基己二酸、肌酐、硫胱醚和乙酰磷酸。 3.检测权利要求1或2所述的生物样品中逍遥散代谢标志物的方法，其特征在于：步骤如下：（1）生物样品处理：生物样品在冰水混合物中解冻后，取200μL并加入800μL乙腈，充分震荡均匀后，4℃下13000 rpm离心20min，取上清液800μL，置于氮气下吹干；加入200μL的v/v 为80%的乙腈-水后，涡旋2 min，0.22 μm滤膜滤过，待UPLC-Q-TOF/MS分析；其中：所述生物样品包括受试抑郁症患者服用逍遥散前和8周后的血浆样本；（2）采用UPLC-Q-TOF/MS检测所述待测溶液，进行代谢轮廓分析，获得数据集；其中：液相条件：流动相A，含0.1%甲酸的水；流动相B，含0.1%甲酸的乙腈；梯度洗脱：0~2min，2% B; 2~3 min，2% B -35% B；3~28 min，35% B-98%B；28~30 min，98% B；30-32 min，98% B-2%B；32-34 min，2% B；进样量: 5 μL; 流速，0.2 mL/min; 柱温: 35 ℃; WatersACQUITYUPLC HSST3 色谱柱( 2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；质谱条件: 采用HESI离子化方式; 喷雾电压：正极，3.5 kV; 负极，2.5 kV；毛细管温度320℃；加热器温度300℃；鞘气流速：35 arb，辅助气流速：10 arb；扫描模式为Full Scan/dd-MS2，采集范围为m/z100~1500，正负离子切换采集模式; 分辨率采用MS Full Scan35000 FWHM，MS /MS 17500 FWHM，NCE 为12.5 eV，25 eV和37.5 eV；（3）根据所得到的数据用分析软件SIMCA-P 14.0构建偏最小二乘法判别分析OPLS-DA模型；构建的模型中S-PLOT载荷图和计算VIP分值，同时获得相应的P值，以VIP值大于1 .0且P值小于0 .05为条件，筛选出能够区分空白组和逍遥散给药组的代谢标志物；采用受试者工作特征曲线（ROC）分析方法对筛选得到的代谢标志物进行逍遥散疗效的诊断能力判定；采用Metpa分析方法对筛选得到的代谢标志物进行富集分析。 4.根据权利要求3所述的检测生物样品中逍遥散代谢标志物的方法，其特征在于：所述生物样品还包括空白生物样品，其是指未服用逍遥散的受试抑郁症患者正常饮食下的空白血浆样品。 5.根据权利要求3所述的检测生物样品中逍遥散代谢标志物的方法，其特征在于：所述代谢轮廓分析具体步骤为：将采集到的所有数据导入SIEVE软件包，自动完成谱峰识别、滤噪的前处理程序，处理参数设置如下：时间范围：0-32min；质量范围：150-1500Da；质量偏差：0.01；最小强度：1%；质量窗：0.02；保留时间窗口：0.02；消除噪音水平：10；变化峰强度阈值：300；最后输出保留时间、精确质荷比和峰面积组成的三维矩阵；利用Xcalibur工作站自带工具将UPLC-Q-TOF/MS采集到全部raw格式文件转换为NetCdf格式文件。 6.根据权利要求3所述的检测生物样品中逍遥散代谢标志物的方法，其特征在于：步骤（3）中构建偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)模型的方法为：采用R软件调用XCMS数据包对 UPLC-Q-TOF/MS原始图谱先后进行滤噪、峰检测、峰对齐以及峰提取操作并生成csv格式文件；相关处理参数为：xcmsSet (full width at half-maximum：fwhm = 4；S/N cutoff xcmsSet (fwhm =4，snthresh =10，max = 20)，group (bw= 20)；将所生成csv格式文件导入Excel中进行峰面积归一化处理后进行多元统计分析；将归一化后的数据导入SIMCA-P 14.0软件中，采用OPLS-DA去除与实验观察无关的随机信息，最大化提取与实验有关的变化来寻找两组之间的差异代谢物；并对OPLS-DA模型进行预测；最后结合S-plot图和计算VIP分值；采用软件SPSS 17.0进行方差分析以确定其统计学意义，最终确定与疾病以及药物疗效相关的差异代谢物，并作相应差异代谢物柱状图。 7.根据权利要求3所述的检测生物样品中逍遥散代谢标志物的方法，其特征在于：步骤（3）中所述代谢标志物以ROC的值≥0.7为条件进行筛选。 8.权利要求2所述的生物样品中逍遥散调节代谢标志物在制备抑郁症药物疗效评估试剂盒中的应用，其特征在于：所述4-羰基2, 3烯基己二酸、肌酐、硫胱醚和乙酰磷酸加合作为整体指标，其ROC曲线下面积大于0.7。
所属类别：	发明专利