详情

原文传递一种发酵虫草菌粉生产全过程链质量控制快速检测方法

专利名称：	一种发酵虫草菌粉生产全过程链质量控制快速检测方法
摘要：	本发明提出一种发酵虫草菌粉生产全过程链质量控制快速检测方法，其特征在于以中药指纹图谱技术为基础，将高效液相色谱法和近红外光谱相融合结合偏最小二乘回归法，建立发酵虫草菌粉生产过程核苷类成分定量分析模型。主要包括以下步骤：①利用高效液相色谱法测定核苷类成分标准含量；②利用中药指纹图谱分析过程核苷图谱的相似度；③采集核苷提取液近红外原始光谱；④光谱预处理；⑤定量模型的建立；⑥模型的验证。本发明具有快速、无损、检测结果准确的特点，可同时检测多种核苷类成分，快速判定各过程核苷类成分含量是否符合标准，最大可能保证发酵虫草菌粉产品中核苷类成分的质量。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	江西;36
申请人：	江西国药有限责任公司
发明人：	陈丽华;朱卫丰;管咏梅;杨明;金晨;史畑女
专利状态：	有效
申请日期：	2019-07-25T00:00:00+0800
发布日期：	2019-10-08T00:00:00+0800
申请号：	CN201910687376.7
公开号：	CN110308226A
代理机构：	北京华科联合专利事务所(普通合伙)
代理人：	孟旭;涂荣昌
分类号：	G01N30/02(2006.01);G;G01;G01N;G01N30
申请人地址：	330052 江西省南昌市小蓝工业园国药大道888号
主权项：	1.一种发酵虫草菌粉生产全过程链质量控制快速检测方法，其特征在于，所述检测方法，步骤如下：供试品溶液的制备：取任何一个批次的实际生产过程中不同生产步骤的发酵虫草菌粉样品，每个样品1.00g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入超纯水40mL，密塞，称定重量，超声处理(功率500w，频率45kHz)30min，放冷，再称定重量，用超纯水补足减少的重量，摇匀，离心(转速4000r/min，10min)，取上清液，过0.22μm微孔滤膜，滤液即为供试品溶液；对供试品溶液进行近红外光谱的采集：智能透射检测器附件，波数为4000-12500cm-1，扫描32次，分辨率为8cm-1，温度25℃，湿度40％，以log1/R形式显示光谱，每个样品扫描3次，取平均光谱；将光谱数据带入建立好近红外光谱定量模型，根据近红外光谱定量模型即可快速准确的读出不同生产过程发酵虫草菌样品5种核苷类成分的含量，并判断样品是否合格。 2.发酵虫草菌粉生产全过程近红外光谱定量模型的建立方法，其特征在于，所述方法，步骤如下：取多批次不同生产过程发酵虫草菌样品，每个样品重量为约1.00g，每个样品精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入超纯水40mL，密塞，称定重量，超声处理(功率500w，频率45kHz)30min，放冷，再称定重量，用超纯水补足减少的重量，摇匀，离心(转速4000r/min，10min)，取上清液，过0.22μm微孔滤膜，滤液即为供试品溶液。将供试品溶液注入高效液相色谱仪，得到色谱图，根据标准曲线计算上述多批次不同生产过程发酵虫草菌样品中5种核苷类成分的含量，其中，所述高效液相色谱仪的色谱条件如下：采用色谱柱ACE Excel5 SuperC 18，(250mm×4.6mm，5μm)，紫外检测器进行检测，检测波长为260nm，柱温30℃，进样量为10μL，以甲醇和水梯度洗脱，流速为1.0mL·min-1，分析时间为50min。洗脱条件如下：时间(分钟) 水(％) 甲醇(％) 0 99 1 15 99 1 30 85 15 40 65 35 47 99 1 50 99 1 采用中药指纹图谱相似度评价系统(2004A版)对上述多批次不同生产过程发酵虫草菌样品核苷类成分的相似性进行评价，如果均为合格品，即可进行近红外光谱模型的建立。近红外快速检测发酵虫草菌粉生产全过程核苷类成分定量模型的建立方法，步骤如下： ①采集上述多批次不同生产过程发酵虫草菌样品的近红外光谱：智能透射检测器附件，波数为4000-12500cm-1，扫描32次，分辨率为8cm-1，温度25℃，湿度40％，以log1/R形式显示光谱，每个样品扫描3次，取平均光谱。 ②光谱预处理：采用TQ Analyst软件分析图谱。固定光程类型为恒定(Constant)，建立偏最小二乘法(PLS)、主成分回归法(PCR)结合原始光谱、一阶导数及二阶导数光谱定量模型。以校正模型、验证模型的均方差(RMSEC、RMSEV)和相关系数(Rc、Rv)为指标，筛选出最佳定量模型。 ③校正集及验证集的划分：将上述多批次不同生产过程发酵虫草菌样品5种核苷类成分含量按照从大到小的顺序排列，确保校正集含量包含验证集含量，按照5:1的比例选取25个校正集，5个验证集。 ④建模区间的选取：结合文献及软件推荐模型区间确定光谱分析波数区间为7317～6927.5cm-1、6738.5～6476.2cm-1、5859～5523.4cm-1、4902.49～4817.64cm-1、4740.49～4107.91cm-1。 ⑤光谱异常样本的剔除：根据光谱的分布差异计算马氏距离鉴别异常值。 ⑥模型验证：选取验证集样品作为外部数据对模型进行验证，以校正模型、验证模型的均方差(RMSEC、RMSEV)和相关系数(Rc、Rv)为指标评价模型。将模型预测值与真实值进行独立样本t检验，评价所建模型的可靠性。 3.根据权利要求2所述的发酵虫草菌粉生产全过程近红外光谱定量模型的建立方法，其特征在于，其中，所述多批次不同生产过程发酵虫草菌样品，包括30批或30批以上的样品。 4.根据权利要求2所述的发酵虫草菌粉生产全过程近红外光谱定量模型的建立方法，其特征在于，其中，所述多批次不同生产过程发酵虫草菌样品，不同过程包括以下操作单元：菌种培养操作单元、菌种传代操作单元、发酵操作单元、滤过操作单元、干燥操作单元、粉碎操作单元、混合操作单元。 5.利用近红外快速检测发酵虫草菌粉生产全过程核苷类成分，将高效液相色谱法-指纹图谱和近红外光谱相融合结合偏最小二乘回归法，建立发酵虫草菌粉生产过程核苷类成分定量分析模型，可同时快速测定发酵过程中多种核苷类成分含量，具体模型建立过程如下： (1)发酵虫草菌粉过程核苷类成分标准含量的测定 ①对照品溶液的制备：分别精密称取尿嘧啶、尿苷、腺嘌呤、鸟苷及腺苷适量溶于10mL容量瓶中，配制成浓度分别为366.00μg/mL、1010.00μg/mL、324.00μg/mL、1217.00μg/mL、1474.00μg/mL的对照品溶液；分别各取1.5mL对照品溶液于10mL容量瓶中，定容至刻度，即得浓度分别为54.90μg/mL，151.50μg/mL，48.60μg/mL，182.55μg/mL，221.10μg/mL的混合对照品溶液。取混合对照品溶液稀释2倍、4倍、8倍、32倍、64倍、100倍、128倍，得到系列浓度混合对照品溶液。 ②供试品溶液的制备：取30批不同过程发酵虫草菌粉约1.00g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入超纯水40mL，密塞，称定重量，超声处理(功率500w，频率45kHz)30min，放冷，再称定重量，用超纯水补足减少的重量，摇匀，离心(转速4000r/min，10min)，取上清液，过0.22μm微孔滤膜，滤液即为供试品溶液。 ③建立标准曲线：核苷的色谱分析采用色谱柱ACE Excel 5 SuperC 18，(250mm×4.6mm，5μm)，紫外检测器进行检测，检测波长为260nm，柱温30℃，进样量为10μL，以甲醇和水梯度洗脱，流速为1.0mL·min-1，分析时间为50min。洗脱条件见表1：表1流动相梯度洗脱条件时间(分钟) 水(％) 甲醇(％) 0 99 1 15 99 1 30 85 15 40 65 35 47 99 1 50 99 1 在1(1)③色谱条件下分析1(1)①系列浓度混合对照品溶液，得到各浓度下5种核苷类成分色谱峰峰面积，以浓度为横坐标，相应峰面积为纵坐标，建立5种核苷类成分标准曲线。 ④色谱分析：将1(1)②制备的供试品溶液按照1(1)③色谱条件进行测定，将得到的5种核苷类成分峰面积代入标准曲线中计算即得核苷类成分的含量。 (2)相似度分析将1(1)④得到的不同批次、不同过程核苷类成分液相色谱图导入中药指纹图谱相似度评价系统(2004A版)分析不同批次、不同过程核苷类成分的相似度。 (3)近红外定量模型的建立 ①过程核苷提取液原始光谱的采集：智能透射检测器附件，波数为4000-12500cm-1，扫描32次，分辨率为8cm-1，温度25℃，湿度40％，以log1/R形式显示光谱，每个样品扫描3次，取平均光谱。 ②光谱预处理：采用TQ Analyst软件分析图谱。固定光程类型为恒定(Constant)，建立偏最小二乘法(PLS)、主成分回归法(PCR)结合原始光谱、一阶导数及二阶导数光谱定量模型。以校正模型、验证模型的均方差(RMSEC、RMSEV)和相关系数(Rc、Rv)为指标，筛选出最佳定量模型。 ③校正集及验证集的划分：将1(1)④测出的不同批次、不同过程5种核苷类成分含量按照从大到小的顺序排列，确保校正集含量包含验证集含量，按照5:1的比例选取25个校正集，5个验证集。 ④建模区间的选取：结合文献及软件推荐模型区间确定光谱分析波数区间为7317～6927.5cm-1、6738.5～6476.2cm-1、5859～5523.4cm-1、4902.49～4817.64cm-1、4740.49～4107.91cm-1。 ⑤光谱异常样本的剔除：根据光谱的分布差异计算马氏距离鉴别异常值。 ⑥模型验证：选取验证集样品作为外部数据对模型进行验证，以校正模型、验证模型的均方差(RMSEC、RMSEV)和相关系数(Rc、Rv)为指标评价模型。将模型预测值与真实值进行独立样本t检验，评价所建模型的可靠性。 6.按权利要求1(1)测定发酵虫草菌粉全过程核苷类成分含量，其特征在于核苷类成分指尿嘧啶、尿苷、腺嘌呤、鸟苷、腺苷组成的含量。 7.按权利要求1(2)分析核苷类成分相似度，其特征在于全过程、不同批次核苷提取液液相色谱的导入。 8.按权利要求1(3)②预处理核苷提取液原始光谱，其特征在于对比分析偏最小二乘法、主成分回归结合一阶导数、二阶导数处理原始光谱，选取偏最小二乘法结合一阶导数处理核苷提取液原始光谱。 9.按权利要求1(3)③选取校正集与验证集，其特征在于校正集与验证集比例为5:1。 10.按按权利要求1(3)④选取建模区间，其特征在于波数区间为7317～6927.5cm-1、6738.5～6476.2cm-1、5859～5523.4cm-1、4902.49～4817.64cm-1、4740.49～4107.91cm-1。
所属类别：	发明专利