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原文传递一种基于活体成像系统研究细菌在体内相互作用的方法

专利名称：	一种基于活体成像系统研究细菌在体内相互作用的方法
摘要：	本发明提供了一种基于活体成像系统研究细菌在体内相互作用的方法，属于微生物领域。本发明提供的研究方法包括如下步骤：步骤1，荧光标记；步骤2，确定最优激发波长和最优发射波长；步骤3，体外光谱评估；步骤4，判断荧光强度；步骤5，实验动物活体成像；步骤6，ROI分析。根据本发明所涉及的研究方法，因为成功构建了两个不同颜色蛋白基因的质粒，所以，本发明通过将两种不同的颜色蛋白基因的质粒转入两种不同菌中，得到两种荧光标记菌株。同时由于本发明中因为荧光标记的两种均各自的最优激发和发射波长下，都有较强的荧光表达，且能与另一株菌明显区分开，所以能够利用活体成像技术观察两种菌在体内的相互作用。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	上海;31
申请人：	上海理工大学
发明人：	艾连中;王光强;夏永军;熊智强;张汇
专利状态：	有效
申请日期：	2019-07-08T00:00:00+0800
发布日期：	2019-10-15T00:00:00+0800
申请号：	CN201910608518.6
公开号：	CN110333208A
代理机构：	上海德昭知识产权代理有限公司
代理人：	程宗德
分类号：	G01N21/64(2006.01);G;G01;G01N;G01N21
申请人地址：	200093 上海市杨浦区军工路516号
主权项：	1.一种基于活体成像系统研究细菌在体内相互作用的方法，所述细菌种类为两种，分别为益生菌以及致病菌，其特征在于，包括如下步骤：步骤1，荧光标记：分别对所述益生菌以及所述致病菌分别进行基因改造，使其分别表达出不同颜色的荧光蛋白基因，分别得到荧光标记的益生菌以及荧光标记的致病菌，进入步骤2；步骤2，确定最优激发波长和最优发射波长：分别确定所述荧光标记的益生菌的最优激发波长λAa以及最优发射波长λAb以及所述荧光标记的致病菌的最优激发波长λBa以及最优发射波长λBb，进入步骤3；步骤3，体外光谱评估：固定激发波长为λAa，对所述荧光标记的益生菌以及所述荧光标记的致病菌进行发射光谱扫描，在发射光波长为λAb时，分别确定荧光标记的益生菌的荧光强度FA1以及所述荧光标记的致病菌的荧光强度FB1；固定激发波长为λBa，对所述荧光标记的益生菌以及所述荧光标记的致病菌进行发射光谱扫描，在发射光波长为λBb时，分别确定荧光标记的益生菌的荧光强度FA2以及所述荧光标记的致病菌的荧光强度FB2；固定发射波长为λAb，对所述荧光标记的益生菌以及所述荧光标记的致病菌进行激发波长光谱扫描，在激发光波长为λAa时，分别确定荧光标记的益生菌的荧光强度FA3以及所述荧光标记的致病菌的荧光强度FB3；固定发射波长为λBb，对所述荧光标记的益生菌以及所述荧光标记的致病菌进行激发波长光谱扫描，在激发光波长为λBa时，分别确定荧光标记的益生菌的荧光强度FA4以及所述荧光标记的致病菌的荧光强度FB4，进入步骤4；步骤4，判断\|λAa-λBa\|≤100,\|λAb-λBb\|≤100,1/50≤FA1/FB1≤50，1/50≤FA2/FB2≤50，1/50≤FA3/FB3≤50，1/50≤FA4/FB4≤50六个式子是否均不成立时，当判断为是时进入步骤5，否则进入步骤1；步骤5，实验动物活体成像：对实验动物进行同时灌胃荧光标记的益生菌以及荧光标记的致病菌，在灌胃后每隔一段时间对实验动物分别在λAa、λBa、λAb、λBb下成像，得实验动物活体成像图，进入步骤6；步骤6，ROI分析：对所述实验动物活体成像图进行ROI定量分析。 2.根据权利要求1所述的基于活体成像系统研究细菌在体内相互作用的方法，其特征在于：其中，所述荧光标记的方法包括如下步骤：步骤1，取含有荧光基因的质粒加入冰上融解的细菌的感受态细胞中，冰上放置15-30min后，35-45℃水浴锅中放置50-80s，再冰上放置1～2min，加入LB培养基至体积为1mL，得培养液，进入步骤2；步骤2，所述培养液在150-200rpm/35-40℃振荡培养0.8-1.2h后，取80-120μL涂布到含250ng/mL-300ng/mL红霉素抗性的LB固体平板上，35-40℃过夜培养。待平板上长出单菌落后，挑取进行菌落PCR验证，将验证正确的阳性菌落保藏待用，即得荧光标记的细菌。 3.根据权利要求1所述的基于活体成像系统研究细菌在体内相互作用的方法，其特征在于：其中，所述荧光标记的方法包括如下步骤：步骤1，将感受态细胞置于冰上解冻，取含有荧光基因的质粒与所述感受态细胞充分混合均匀，转移至冰上预冷的电击转化杯中，使混合物落入底部，调整电压仪到1.8-2.5kV，电击转化杯，迅速向转化杯中加入MMRS复苏培养基，得中间体A；步骤2，将所述中间体A混匀后转移至离心管中，35-40℃静置培养1-3h。涂布到含有8-12μg/mL红霉素抗性的MRS固体平板上，35-40℃培养40-50h，待平板上长出单菌落后，挑取所述单菌落，在靶向基因上下游同源臂外侧基因组80-120bp处设计验证引物，进行菌落PCR验证；步骤3，将验证有正确条带的阳性转化子挑取到MRS液体培养基吹吸重悬，沾取菌液划线接种于无任何抗性的MRS固体平板上，35-40℃培养至单菌落长出，挑取单菌落，用验证引物进行菌落PCR验证；步骤4，重复步骤3直至有纯种菌株出现，即得荧光标记的细菌。 4.根据权利要求2或3所述的基于活体成像系统研究细菌在体内相互作用的方法，其特征在于：其中，含有荧光基因的质粒为pLCNICK-1628-RFP质粒或pIB184-GFP质粒，所述pLCNICK-1628-RFP质粒为敲除LC2W-1628基因并插入RFP基因的CRISPR/Cas9D10A质粒，所述pIB184-GFP质粒为GFP基因的过表达质粒。 5.根据权利要求1所述的基于活体成像系统研究细菌在体内相互作用的方法，其特征在于：其中，所述确定最优激发波长和最优发射波长的方法为从LB固体平板上挑取活化好的所述荧光标记的细菌的单菌落接种到含有3-5mL液体LB培养基的试管中，于35-40℃摇床振荡，过夜培养12-16h，再以3500-4500rpm/3-5min离心菌液收集菌体，用无菌磷酸缓冲盐溶液冲洗菌体2-3次并重悬，调节菌浓至109-1010 CFU/mL，取150-220μL置于黑色平底的96孔板中，利用酶标仪扫描出最佳激发波长和最佳发射波长。
所属类别：	发明专利