详情

原文传递一种神经球免疫荧光染色的方法

专利名称：	一种神经球免疫荧光染色的方法
摘要：	本发明公开了一种神经球免疫荧光染色的方法：(1)神经球清洗：取悬浮培养的神经球，离心，弃上清，重悬神经球，再次离心，弃上清；(2)固定；(3)通透及封闭；(4)一抗孵育；(5)漂洗；(6)二抗孵育；(7)漂洗；(8)封片：加入PBS缓冲液，重悬，滴加于载玻片上，滴加抗荧光淬灭剂，加盖盖玻片，将神经球压平封片，用于荧光显微镜观察。本发明利用神经球直径大、肉眼可见的特性，直接采用低速离心将细胞收集管底，避免神经球在染色过程中丢失，能够保持神经球原有细胞形态及内部结构，有效避免细胞爬片过程中造成的的抗原特性改变；采用物理挤压法直接对神经球进行压片，将神经球挤压成薄膜状，无需进行切片，对设备要求低。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	北京;11
申请人：	北京银丰鼎诚生物工程技术有限公司
发明人：	和会娟;杨敏;闫红;张俊利;曹晓红;曹启龙
专利状态：	有效
申请日期：	2019-08-29T00:00:00+0800
发布日期：	2019-10-25T00:00:00+0800
申请号：	CN201910808706.3
公开号：	CN110376044A
代理机构：	山东舜天律师事务所
代理人：	李新海
分类号：	G01N1/30(2006.01);G;G01;G01N;G01N1
申请人地址：	100176 北京市大兴区北京经济技术开发区中和街14号
主权项：	1.一种神经球免疫荧光染色的方法，其特征在于：包括以下步骤： (1)神经球清洗：取悬浮培养的神经球，离心，弃上清，重悬神经球，再次离心，弃上清； (2)固定：加入固定剂，轻柔混匀，室温静置30分钟，每5分钟轻弹管底，使神经球与固定液充分接触，离心，弃上清； (3)神经球通透及封闭：加入通透及封闭液，摇床上孵育30～60分钟，然后离心，弃上清；所述通透及封闭液，是由6％BSA溶液与1％Triton X-100溶液等体积混合而成； (4)一抗孵育：加入适当稀释的一抗，并轻柔混匀，4℃环境下孵育8～12小时，离心，弃上清； (5)漂洗：加入PBST重悬神经球，摇床清洗，离心，弃上清；重复若干次； (6)二抗孵育：加入适当稀释的二抗，轻柔混匀，摇床孵育3小时，离心，弃上清； (7)漂洗：加入PBST重悬神经球，摇床清洗，离心，弃上清；重复若干次； (8)封片：加入PBS缓冲液，轻弹使神经球重悬，将重悬的神经球滴加于洁净的载玻片上，置于超净台中避光风干；于神经球处滴加一滴含DAPI的抗荧光淬灭剂，再加盖一张盖玻片，轻轻将神经球压平封片，用于荧光显微镜观察。 2.根据权利要求1所述的神经球免疫荧光染色的方法，其特征在于：所述神经球的直径在200um以内。 3.根据权利要求1所述的神经球免疫荧光染色的方法，其特征在于：所述离心的具体参数为：400g，离心5分钟。 4.根据权利要求1所述的神经球免疫荧光染色的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，加入PBS缓冲液重悬神经球。 5.根据权利要求1所述的神经球免疫荧光染色的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，固定剂为4％多聚甲醛溶液。 6.根据权利要求1所述的神经球免疫荧光染色的方法，其特征在于：所述摇床的转速为50转/分钟。 7.根据权利要求1所述的神经球免疫荧光染色的方法，其特征在于：所述轻柔混匀的具体方式为：轻弹管底使神经球悬浮并轻柔颠倒混匀2～3次。 8.根据权利要求1所述的神经球免疫荧光染色的方法，其特征在于：所述抗体孵育的具体方式为：用3％BSA溶液进行抗体稀释，离心管斜放，保证神经球与抗体充分接触。 9.根据权利要求1所述的神经球免疫荧光染色的方法，其特征在于：所述摇床清洗的具体方式为：向离心管中加入PBST，轻弹管底使神经球悬浮并轻柔颠倒混匀2～3次，然后斜放至摇床。 10.根据权利要求1或9所述的神经球免疫荧光染色的方法，其特征在于：所述PBST，为含有0.5％Triton X-100的PBS溶液。
所属类别：	发明专利