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原文传递一种PCR产物磁珠法纯化联合快速荧光定量检测试剂盒及其检测方法

专利名称：	一种PCR产物磁珠法纯化联合快速荧光定量检测试剂盒及其检测方法
摘要：	本发明公开了一种PCR产物磁珠法纯化联合快速荧光定量检测试剂盒及其检测方法，所述试剂盒由PCR产物磁珠法纯化试剂、荧光免疫层析定量检测试纸条组成。磁珠法纯化试剂由超顺磁性磁珠分散在核酸吸附液中组成，通过选择性富集PCR产物，可有效地去除寡聚核甘酸、引物二聚体、盐、蛋白质等污染；所述检测试纸条由样品垫、包被荧光微球抗体(抗DNA扩增产物一端标记物)偶联物的结合垫、包含检测线(抗DNA扩增产物另一端标记物)和质控线的NC膜、吸水纸以及PVC胶板组成。本发明试剂盒，操作简便、快捷，结果准确并且判读实现数字化定量，有利于实际应用。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	江苏;32
申请人：	南京东纳生物科技有限公司
发明人：	张宇;王建国;韩国志
专利状态：	有效
申请日期：	2018-04-04T00:00:00+0800
发布日期：	2019-10-18T00:00:00+0800
申请号：	CN201810318419.X
公开号：	CN110346553A
分类号：	G01N33/533(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	211112 江苏省南京市江宁区龙眠大道568号南京生命科技创新园2号楼北区6-7层
主权项：	1.一种PCR产物磁珠法纯化联合快速荧光定量检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒由PCR产物磁珠法纯化试剂、洗涤液、洗脱液、荧光免疫层析定量检测试纸条组成。 2.根据权利要求1所述一种PCR产物磁珠法纯化联合快速荧光定量检测试剂盒，其特征在于所述PCR产物磁珠法纯化试剂由磁珠分散在吸附液中组成。 3.根据权利要求2所述一种PCR产物磁珠法纯化联合快速荧光定量检测试剂盒，其特征在于所述磁珠由具有超顺磁性的铁氧体纳米粒子，包括Fe3O4纳米粒子、γ-Fe2O3纳米粒子或掺杂过渡金属元素及其化合物的铁氧体纳米粒子等构成的微球或与高分子复合而形成的微球，尺寸100nm-10μm，其外壳使用二氧化硅包覆或含有羧基的高分子包覆。 4.根据权利要求2所述一种PCR产物磁珠法纯化联合快速荧光定量检测试剂盒，其特征在于，吸附液为高盐低pH溶液，其主要成分包括1-5M的氯化钠、氯化钾、醋酸钠、醋酸钾，5％-50％质量的PEG、PVP，10-50％体积的乙醇、异丙醇，由其中两种或两种以上组分组成，所用高分子分子量介于2000-50000g/mol。 5.根据权利要求1所述一种PCR产物磁珠法纯化联合快速荧光定量检测试剂盒，其特征在于所述荧光免疫层析定量检测试纸条组成包括底板、吸水纸、硝酸纤维膜、结合垫、样品垫；所述底板上粘贴硝酸纤维膜，硝酸纤维膜的一端连接吸水纸、另一端粘贴结合垫，所述结合垫上搭接样品垫；所述硝酸纤维膜上设有一条包被有二抗的质控线C线，还设有一条与所述质控线C线平行的包被有抗B抗体(能与DNA一端标记物特异结合)的检测线T线；所述结合垫包被有荧光微球抗A抗体(能与DNA另一端标记物特异结合)偶联物；所述试纸条装在卡克中，上盖上设置有加样窗口和信号读取窗口，其中加样窗口与样品垫对应，信号读取窗口与质控线C线、检测线T线对应。 6.根据权利要求5所述一种PCR产物磁珠法纯化联合快速荧光定量检测试剂盒，其特征在于所述的抗A抗体和抗B抗体，可选自链霉亲和素、抗地高辛抗体或抗荧光染料抗体，所述抗荧光染料抗体可选自抗Fam抗体、抗FITC抗体、抗Cy3抗体、抗Cy5抗体、抗Tetramethylrhodamine抗体、抗AlexaFlour抗体等；抗B抗体应选用与抗A抗体不同的抗体。 7.根据权利要求5所述一种PCR产物磁珠法纯化联合快速荧光定量检测试剂盒，其特征在于进行PCR扩增的引物上标记有特定标记物，可选自生物素、地高辛、荧光染料等，使扩增后的DNA产物两端分别含有不同的标记物。 8.根据权利要求1所述一种PCR产物磁珠法纯化联合快速荧光定量检测试剂盒，其特征在于所述的PCR产物，包括PCR直接扩增DNA产物、从凝胶样本回收的PCR扩增DNA产物以及等温扩增DNA产物。 9.根据权利要求1-8所述一种PCR产物磁珠法纯化联合快速荧光定量检测试剂盒的检测方法为： 1)将PCR产物磁珠法纯化试剂与PCR产物混匀，形成固液均相分散混浊液； 2)利用磁场将吸附有PCR产物的磁珠从分散悬浊液中磁分离吸附在管壁上，吸弃上清液； 3)使用洗涤液将吸附有PCR产物的磁性纳米复合材料洗涤两次，洗涤过程中无需将磁性纳米材料吹打散开；其中，所述洗涤液为85％乙醇溶液或以高浓度钠盐、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐为主要组分，辅以5～50mM的乙二胺四乙酸二钠、乙酸钠的高盐溶液； 4)待磁性纳米复合材料表面洗涤液挥发完全后，使用洗脱液将DNA从磁性纳米复合材料中解析出来；其中，所述洗脱液为去离子水或10mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液，其pH为8.0； 5)在核酸洗脱液保存管中加入运行缓冲液至终体积100μL并混合均匀； 6)滴加100微升样品到荧光免疫层析定量检测试纸条的样品垫上，1-3分钟后用免疫荧光定量分析仪读取荧光信号值。
所属类别：	发明专利