详情

原文传递一种副猪嗜血杆菌抗体检测方法及其试剂盒

专利名称：	一种副猪嗜血杆菌抗体检测方法及其试剂盒
摘要：	本发明公开了一种新型副猪嗜血杆菌抗体间接ELISA检测方法，涉及抗体的检测领域，尤其涉及利用一种重组截短蛋白P2检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA检测方法及其试剂盒。这种副猪嗜血杆菌间接ELISA检测方法通过截短表达一种重组副猪嗜血杆菌外膜蛋白P2，并以该蛋白作为包被抗原，并通过对ELISA反应条件、检测方式和临界值确定方式的优化；能够实现对副猪嗜血杆菌抗体的准确检测，具有较好的特异性和敏感性；有效解决了在抗体检测过程中本底过高的问题；并较大程度降低了检测成本。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	江苏;32
申请人：	南京农业大学
发明人：	范红结;张鹏云;周红;蔺辉星
专利状态：	有效
申请日期：	2019-08-16T00:00:00+0800
发布日期：	2019-10-25T00:00:00+0800
申请号：	CN201910756529.9
公开号：	CN110376388A
代理机构：	南京天华专利代理有限责任公司
代理人：	竞存;徐冬涛
分类号：	G01N33/68(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	211225 江苏省南京市溧水区白马镇国家农业科技园南京农业大学基地
主权项：	1.一种检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒采用截短表达和纯化的副猪嗜血杆菌外膜重组蛋白P2作为包被抗原包被的酶标板，所述副猪嗜血杆菌截短外膜重组蛋白P2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，截短表达的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。 2.根据权利要求1所述的检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述重组蛋白P2的制备方法为： (1)以副猪嗜血杆菌血清5型菌株的基因组DNA为模板，设计一对特异性引物P2F/P2R进行扩增： P2F：5’-CGGGATCCACAGTTTATGAAAATGAAG-3’(SEQ ID NO.3)； P2R：5’-GCGTCGACTCTTGCGCCAGTTCTTACG-3’(SEQ ID NO.4)； (2)将PCR产物回收后用BamH I和Sal I进行双酶切，将酶切片段插入到质粒pET-28a的BamH I和Sal I酶切位点之间构建原核表达质粒pET-28a-P2； (3)将构建的原核表达质粒pET-28a-P2转化BL21表达菌获得重组表达菌，IPTG诱导其表达目的蛋白； (4)将菌液离心收集沉淀，将沉淀重溶于PBS中，经超声破菌后离心取沉淀获得重组蛋白P2包涵体； (5)将得到的重组蛋白P2包涵体采用His标签亲和层析的方法进行纯化，得到重组蛋白P2，作为检测抗原。 3.根据权利要求1所述的检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，重组蛋白P2的包被浓度为4μg/mL，所述包被液为pH 9.6的碳酸盐缓冲液，优选的，包被液为pH 9.6的0.05mol/L的碳酸盐缓冲液。 4.根据权利要求1所述的检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含封闭液，所述封闭液为2％的明胶。 5.根据权利要求1～4任一项所述的检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含待检血清、阳性参照血清、阴性参照血清、酶结合物、洗涤液、显色液和终止液。 6.根据权利要求5所述的检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述样品稀释液为PBST，酶结合物为HRP标记的山羊抗猪IgG，洗涤液为PBST，显色液为TMB显色液，终止液为2mol/L的硫酸溶液。 7.一种新型副猪嗜血杆菌抗体间接ELISA检测方法，其特征在于，包括以下步骤： (1)包被：以pH 9.6的碳酸盐缓冲液为包被液将氨基酸序列如SEQ ID NO.2的重组蛋白P2稀释为4μg/mL，在酶标板奇数列各孔均加入100μL；同时在酶标板偶数列各孔均只加入100μL包被液作为空白对照，4℃包被过夜；优选的，所述包被液为pH 9.6的0.05mol/L的碳酸盐缓冲液，所述包被时间为12-16h。 (2)封闭：甩干酶标板中的液体，用PBST洗4遍，每遍每孔均加入300μL，静置5min，最后一遍后甩干孔中液体，向每孔中加入250μL的2％明胶封闭液，37℃封闭2h； (3)待检血清孵育：甩干酶标板中的液体，用PBST洗4遍，每遍每孔均加入300μL，静置5min，最后一遍后甩干孔中液体，分别设置标准阳性对照孔(含抗原)、标准阳性对照孔(不含抗原)、标准阴性对照孔(含抗原)、标准阴性对照孔(不含抗原)和待检血清孔(含抗原)、待检血清孔(不含抗原)，所述标准阳性对照孔为向两组奇数孔和偶数孔中分别加入以PBST作100倍稀释的标准阳性对照血清100μL，所述两组奇数孔中得到两组标准阳性对照孔(含抗原)，所述两组偶数孔中得到两组标准阳性对照孔(不含抗原)；所述标准阴性对照孔为向另两组奇数孔和偶数孔中分别加入以PBST作100倍稀释的标准阴性对照血清100μL，所述两组奇数孔中得到两组标准阴性对照孔(含抗原)，所述两组偶数孔中得到两组标准阴性对照孔(不含抗原)；所述待检血清孔为向其余的奇数孔和偶数孔中分别加入相应的100μL以PBST作100倍稀释的待检血清，得到待检血清孔(含抗原)和待检血清孔(不含抗原)；上述样品37℃孵育1h； (4)二抗孵育：甩干酶标板中的液体，用PBST洗4遍，每遍每孔均加入300μL，静置5min，最后一遍后甩干孔中液体，向每孔中加入100μL的以PBST作10000倍稀释的HRP标记的羊抗猪IgG，37℃孵育1h； (5)显色：甩干酶标板中的液体，用PBST洗4遍，每遍每孔均加入300μL，静置5min，最后一遍后甩干孔中液体，向每孔中加入100μL的TMB显色液，37℃避光显色15min，再向各孔中分别加入50μL的终止液，所述终止液为2mol/L的硫酸溶液，15min以内在酶标仪上读其OD450数值； (6)结果计算：标准阳性对照检测值分别为P[OD450(含抗原)]和P[OD450(不含抗原)]，待检血清的检测值为S[OD450(含抗原)]和S[OD450(不含抗原)]，所述P[OD450(含抗原)]为两组标准阳性对照孔(含抗原)的OD450平均值，所述P[OD450(不含抗原)]为两组标准阳性对照孔(不含抗原)的OD450平均值；所述S[OD450(含抗原)]为各奇数待检血清孔的OD450，所述S[OD450(不含抗原)]为各偶数待检血清孔的OD450；通过其计算各自的校正值分别为：标准阳性校正值＝ΔP[OD450(含抗原)-OD450(不含抗原)] 待检血清校正值＝ΔS[OD450(含抗原)-OD450(不含抗原)] 再计算每种待检血清的比率R，具体为：通过比率R的大小判定样品阴阳性。 8.根据权利要求7所述的新型副猪嗜血杆菌抗体间接ELISA检测方法，其特征在于，检测时所有标准阴性血清、标准阳性血清和待检血清均做不包被抗原孔的空白对照。 9.根据权利要求7所述的新型副猪嗜血杆菌抗体间接ELISA检测方法，其特征在于，当待检血清比率R≥0.275时，待检血清中的副猪嗜血杆菌抗体检测结果判定为阳性；当待检血清比率R＜0.275时，待检血清中的副猪嗜血杆菌抗体检测结果判定为阴性。 10.根据权利要求7所述的新型副猪嗜血杆菌抗体间接ELISA检测方法，其特征在于，所述步骤(6)的结果计算还包括计算标准阴性血清的比率R，标准阴性对照检测值分别为N[OD450(含抗原)]和N[OD450(不含抗原)]，所述N[OD450(含抗原)]为两组标准阴性对照孔(含抗原)的OD450平均值，所述N[OD450(不含抗原)]为两组标准阴性对照孔(不含抗原)的OD450平均值，通过其计算各自的校正值分别为：所述标准阴性校正值＝ΔN[OD450(含抗原)-OD450(不含抗原)]；所述标准阳性校正值＝ΔP[OD450(含抗原)-OD450(不含抗原)]；再计算标准阴性血清的比率R：具体为：所述标准阴性血清R应小于0.275。
所属类别：	发明专利