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原文传递肽酰基精氨酸脱亚胺酶(PAD)的新型测活法

专利名称：	肽酰基精氨酸脱亚胺酶(PAD)的新型测活法
摘要：	本发明公开了肽酰基精氨酸脱亚胺酶(PAD)的新型测活法，包括试剂，所述试剂包括链霉亲和素，FBNA‑2肽的水溶液，PAD酶样品，胰蛋白酶，润洗液，PAD缓冲液，胰蛋白酶缓冲液，HRP标记的抗6xHIS抗体，四甲基联苯胺(TMB)底物溶液，2M硫酸，所述链霉亲和素包被8孔条板，所述FBNA‑2肽的水溶液为0.5mg/ml，所述胰蛋白酶，10mg/ml溶解于低酸度储存液中；本发明结合了第一部分中列举的几乎所有当前PAD测活方法的优势，尤其是免疫分析法的高灵敏度，易操作性，与胰蛋白酶法的低成本优势，除了方案设计中的新型底物，其它所有试剂均为生物实验室常用试剂，因而很容易获取。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	江苏;32
申请人：	苏州新格诺康生物技术有限公司
发明人：	来棽棽;姚晓晖;谢志伟;严俊
专利状态：	有效
申请日期：	2019-08-28T00:00:00+0800
发布日期：	2019-11-08T00:00:00+0800
申请号：	CN201910801766.2
公开号：	CN110426514A
分类号：	G01N33/558(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	215000 江苏省苏州市工业园区星湖街218号生物纳米园A7楼203室
主权项：	1.肽酰基精氨酸脱亚胺酶(PAD)的新型测活法，包括试剂，其特征在于：所述试剂包括链霉亲和素，FBNA-2肽的水溶液，PAD酶样品，胰蛋白酶，润洗液，PAD缓冲液，胰蛋白酶缓冲液，HRP标记的抗6xHIS抗体，四甲基联苯胺(TMB)底物溶液，2M硫酸。 2.根据权利要求1所述的肽酰基精氨酸脱亚胺酶(PAD)的新型测活法，其特征在于：所述链霉亲和素包被8孔条板，所述FBNA-2肽的水溶液为0.5mg/ml。 3.根据权利要求1所述的所述的肽酰基精氨酸脱亚胺酶(PAD)的新型测活法，其特征在于：所述FBNA-2肽的分子序列为：Biotin-GGSGG SYSAQ FTSST SYNRG DSTFE SHHHH HH。 4.根据权利要求1所述的肽酰基精氨酸脱亚胺酶(PAD)的新型测活法，其特征在于：所述胰蛋白酶，10mg/ml溶解于低酸度储存液中。 5.根据权利要求1所述的肽酰基精氨酸脱亚胺酶(PAD)的新型测活法，其特征在于：所述润洗液，1x TBS(25mM Tris,150mM NaCl,pH 7.2),0.1％BSA and 0.05％Tween-20。 6.根据权利要求1所述的肽酰基精氨酸脱亚胺酶(PAD)的新型测活法，其特征在于：所述PAD缓冲液，0.1M Tris-HCl(pH 7.4),10mM CaCl2,使用前加入0.5mM DTT及1mM PMSF，所述胰蛋白酶缓冲液，50mM Tris-HCl(pH 8.0),2.5mM EDTA。 7.根据权利要求1所述的肽酰基精氨酸脱亚胺酶(PAD)的新型测活法，其特征在于：所述测活步骤包括： S1：用润洗液稀释FBNA-2肽至0.5ug/ml作为包被液； S2：在ELISA板架中安装8孔条板，润洗条板3次后将板倒置于洁净吸水纸上并拍干； S3：往每孔中加入100ul包被液，室温下孵育1小时； S4：弃去条板中的溶液，用润洗液润洗4次后将板倒置于洁净吸水纸上并拍干； S5：用PAD缓冲液将酶稀释至所需浓度，加入50ul至每孔中，将条板置于37C孵育30分钟； S6：重复第4步； S7：每孔中加入100ul胰蛋白酶缓冲液，平衡后弃去溶液； S8：将胰蛋白酶以缓冲液稀释1000倍后，加100ul至条板的每个反应孔中，置于37℃孵育1小时； S9：重复第4步； S10：将HIS检测抗体以润洗液稀释10倍后，加100ul至条板的每个反应孔中，置于室温孵育1小时； S11：重复第4步； S12：将TMB溶液平衡至室温后，加100ul至条板的每个反应孔中，置于室温，避光环境中孵育20分钟； S13：加50ul 2M硫酸至反应孔以终止显色反应，轻微震动条板，此时溶液颜色由蓝色转变为黄色，在30分钟内于450nm和540nm分别读取每孔的吸光度。
所属类别：	发明专利