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原文传递一种舍曲林检测试剂及其制备和使用方法

专利名称：	一种舍曲林检测试剂及其制备和使用方法
摘要：	本发明涉及一种舍曲林检测试剂及其制备和使用方法。通过反复试验获得了一种全新的舍曲林马来酰亚胺衍生物，并使用该舍曲林马来酰亚胺衍生物制备得到高免疫原性的舍曲林免疫原，进而免疫实验动物得到高效价的抗舍曲林特异性抗体；同时，使用该舍曲林马来酰亚胺衍生物制备得到舍曲林酶标偶联物。含有上述抗舍曲林特异性抗体与舍曲林酶标偶联物的舍曲林检测试剂可以实现在全自动生化分析仪上对舍曲林含量的自动化测定，可以高通量、快速化、精确地测定生物样本中舍曲林的含量，且具有操作简便、灵敏度高、特异性强、结果准确等优点，有效降低舍曲林检测成本，有利于临床广泛推广使用。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	江苏;32
申请人：	苏州博源医疗科技有限公司
发明人：	崔丽艳;虞留明
专利状态：	有效
申请日期：	2019-08-20T00:00:00+0800
发布日期：	2019-11-15T00:00:00+0800
申请号：	CN201910767565.5
公开号：	CN110456087A
分类号：	G01N35/00(2006.01);G;G01;G01N;G01N35
申请人地址：	215163江苏省苏州市高新区锦峰路8号9号楼101、201室
主权项：	1.一种舍曲林检测试剂，其特征在于，包括试剂R1和试剂R2，所述试剂R1中包含抗舍曲林特异性抗体和均相酶底物溶液；所述试剂R2包含舍曲林酶标偶联物和R2缓冲液。 2.根据权利要求1所述的舍曲林检测试剂，其特征在于，制备方法包括以下步骤： A.试剂R1的制备：将质量分数3.5%的氧化态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、3.5%的葡萄糖-6-磷酸、0.12%的甲基化牛血清白蛋白、0.03%的NaN3的用75 mmol/L、pH=7.8的Tris缓冲液溶解制成均相酶底物溶液；再将抗舍曲林特异性抗体加入所述均相酶底物溶液中混匀，得到试剂R1，所述抗舍曲林特异性抗体与均相酶底物溶液的体积比为1:100～1:10000；优选地，所述抗舍曲林特异性抗体与均相酶底物溶液的体积比为1:900； B.试剂R2的制备：将质量分数0.12%的甲基化牛血清白蛋白、0.03%的NaN3用150 mmol/L、pH=8.5的Tris缓冲液溶解制成R2缓冲液，再将舍曲林酶标偶联物加入所述R2缓冲液中混匀，得到试剂R2，所述舍曲林酶标偶联物与R2缓冲液的体积比为1:100～1:10000；优选地，所述舍曲林酶标偶联物与R2缓冲液的体积比为1:3600。 3.根据权利要求1-2中任一项所述的舍曲林均相酶免疫检测试剂，其特征在于，所述的抗舍曲林特异性抗体，由舍曲林免疫原免疫实验动物后产生，所述抗体为完整抗体分子，或者为保留与舍曲林特异性结合能力的抗体片段或抗体衍生物，所述实验动物为山羊、绵羊、小鼠、豚鼠、兔或马中的一种，优选为山羊；所述抗舍曲林特异性抗体的制备方法，包括以下步骤： a.用PBS缓冲液将舍曲林免疫原稀释至2.5 mg/ml，得到免疫原溶液，然后用2.5 ml所述免疫原溶液与等量弗氏完全佐剂混合，对实验动物进行注射； b.2周后，再用2.5 ml相同的免疫原溶液与等量弗氏不完全佐剂混合，对上述实验动物注射一次，之后每隔4周注射一次，共计注射5次； c.对免疫后的实验动物取血，分离纯化得到抗舍曲林特异性抗体。 4.根据权利要求3所述的舍曲林均相酶免疫检测试剂，其特征在于，所述舍曲林免疫原由舍曲林马来酰亚胺衍生物与载体连接而成，其结构式如下述式（Ⅰ）所示：式（Ⅰ）；所述载体为具有免疫原性的甲基化蛋白质或多肽，选自甲基化血清蛋白、甲基化卵清蛋白、甲基化血蓝蛋白或甲基化甲状腺球蛋白中的一种，优选为甲基化血清蛋白，更优选为甲基化牛血清白蛋白；所述舍曲林免疫原的制备方法，包括以下步骤：（1）将质量分数1.25%的载体蛋白溶解于0.3 mmol/L，pH=8.0的磷酸缓冲液中，得到载体蛋白溶液；（2）将质量分数0.8%的舍曲林马来酰亚胺衍生物、7.5%的二甲基甲酰胺、7.5%的乙醇溶解于20 mmol/L，pH=5.2的磷酸钾缓冲液中，再加入质量分数0.8%的1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺，将上述化学物质在0℃下搅拌反应120分钟；（3）将步骤（2）中溶解好的溶液缓慢滴加至步骤（1）中的载体蛋白溶液中，并在-8℃下搅拌48小时，得到偶联物溶液，将反应后的偶联物溶液进行透析纯化，纯化后所得溶液即为舍曲林免疫原溶液，在舍曲林免疫原溶液中加入质量分数0.08%的NaN3，于-20℃下储存。 5.根据权利要求1-2中任一项所述的舍曲林均相酶免疫检测试剂，其特征在于，所述的舍曲林酶标偶联物由舍曲林马来酰亚胺衍生物与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶连接而成，其结构式如下述式（Ⅱ）所示：式（Ⅱ）；所述舍曲林酶标偶联物的制备方法，包括以下步骤： ①葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液的制备：将质量分数5.0%的规格为300KU的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，室温下溶解于含有0.08 mol/L Tris、6.0 mmol/L MgCl2和3.3 mmol/L NaCl，pH=9.2的溶液中；在此溶液中加入质量分数12.5%的还原态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、7.5%的葡萄糖-6-磷酸以及1.25%的卡必醇；加热到37℃，再缓慢加入质量分数0.75%的二甲基亚砜，摇匀后静置60秒； ②舍曲林马来酰亚胺衍生物的激活：在无水状态下将质量分数0.8%的舍曲林马来酰亚胺衍生物，溶解于7.5%的二甲基甲酰胺中；将此溶液温度降到-8℃；然后加入2.25%的三丁胺、2.75%的氯甲酸异丁酯、1.75%的碳二亚胺；0.75%的N-羟基硫代琥珀酰亚胺；0℃搅拌120分钟； ③葡萄糖-6-磷酸脱氢酶与舍曲林马来酰亚胺衍生物的连接：将步骤②中激活的温度为0℃的舍曲林马来酰亚胺衍生物溶液逐滴加入到步骤①中溶解的温度为37℃的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液中；-4℃搅拌48小时； ④纯化产物：将反应后的连接产物通过G-25葡聚糖凝胶层析柱进行纯化，纯化后所得溶液即为舍曲林酶标偶联物溶液，在舍曲林酶标偶联物溶液中加入质量分数0.8%的BSA和质量分数0.08%的NaN3，于-20℃下储存。 6.根据权利要求4-5中任一项所述的舍曲林均相酶免疫检测试剂，其特征在于，所述的舍曲林马来酰亚胺衍生物，其结构式如下述式（Ⅲ）所示：式（Ⅲ）；上述式（Ⅲ）所示的舍曲林马来酰亚胺衍生物的合成路线如下：。 7.根据权利要求6所述的舍曲林均相酶免疫检测试剂，其特征在于，所述的舍曲林马来酰亚胺衍生物的合成路线，具体制备步骤如下：（a）化合物2的合成：称取7.8 g化合物1溶解于100 ml三氟乙酸中，然后加入7ml三氟甲磺酸和2.3 g硝酸钾，制成反应混合液，室温下搅拌1.5 小时，在此反应混合液中加入100ml纯化水，然后用100ml乙酸乙酯萃取2次，将萃取得到的有机物用200ml卤水冲洗，用MgSO4干燥后进行过滤，再通过减压的方法除去溶剂，最后将得到的粗产物经硅胶纯化得到化合物2，；（b）化合物3的合成：将15 g化合物2溶解于300 mL乙醇中，然后加入21 g铁粉混合，将以上混合物回流加热16小时，而后将反应物冷却并进行过滤，将收集到的滤液浓缩得到粗品，再用SiO2快速色谱分析柱对粗品进行纯化，得到化合物3，；（c）化合物4的合成：将13.7 g化合物3加入26 mL甲酸中溶解，然后在0℃下加入由25mL甲酸和49 mL乙酸酐配制的溶液，将此混合物在室温下搅拌2小时，再加入冰水，并用二氯甲烷进行萃取，萃取得到的有机物用1mol/L的氢氧化钠水溶液冲洗，再用卤水洗涤，用Na2SO4进行干燥，过滤后减压除去溶剂，粗产物用硅胶进行纯化，最后用溶剂浓度梯度为100:0-95:5的二氯甲烷:甲醇溶处理，得到化合物4，；（d）化合物5的合成：将10 g化合物4加入285 ml丙酮中溶解，然后加入57 ml浓硫酸和285 ml纯化水组成的混合物，并放入冰水浴中，再加入2.2 g亚硝酸钠，将此混合物在冰水浴中搅拌0.5小时，然后加热至室温，将上述混合物在75℃下加热反应2小时，在冰水浴中冷却，再用高浓度的氢氧化铵水溶液终止反应，将反应混合物用乙酸乙酯萃取3次，萃取得到的有机物用纯化水冲洗，用Na2SO4干燥，过滤后减压除去溶剂，粗产物用硅胶进行纯化，最后用溶剂浓度梯度为100:0的二氯甲烷:甲醇到95:5的二氯甲烷:甲醇处理，得到化合物5，；（e）化合物6的合成：将3.5 g化合物5加入50 ml二甲基甲酰胺中溶解，然后在0℃下加入1.8 g 4-溴丁酸甲酯与2.8 g K2CO3，再将此混合物在室温下搅拌12小时，然后通过减压蒸发溶剂，最后用SiO2快速色谱分析柱纯化得到化合物6，；（f）舍曲林酸衍生物的合成：将2.6 g化合物6加入50 ml MeOH中溶解，然后加入0.25g LiOH，再将此混合物在室温下搅拌12小时，然后通过减压蒸发溶剂，最后用SiO2快速色谱分析柱纯化得到舍曲林酸衍生物，；（g）舍曲林马来酰亚胺衍生物的合成：将0.8 g舍曲林酸衍生物加入5 ml二甲基甲酰胺中溶解，然后的加入1 ml 二异丙基乙胺，0.9 g HATU和0.3 g化合物7，将此反应混合物在室温下搅拌12小时，反应结束后在混合物中加入20 mL纯化水，然后进行过滤，滤渣采用制备级高效液相色谱进行纯化，得到舍曲林马来酰亚胺衍生物，。 8.一种如权利要求1所述的舍曲林检测试剂的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：（一）在全自动生化分析仪中加入待测样本、R1试剂，混匀，37℃温育3-5分钟；（二）加入R2试剂，混匀，37℃恒温5-10分钟后，340 nm波长进行检测，连续监测3分钟内的吸光度变化率，由全自动生化分析仪自动计算待测样本中舍曲林的含量；所述试剂R1与试剂R2按1:1～4:1的体积比使用，优选按4:1的体积比使用。 9.根据权利要求8所述的舍曲林检测试剂的使用方法，其特征在于，所述的待测样本为生理样本；优选地，所述的生理样本为血清、血浆、尿液、唾液；更优选地，所述的生理样本为血清或血浆。
所属类别：	发明专利