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原文传递一种偶联抗EpCAM抗体的免疫磁珠富集检测CTCs的方法

专利名称：	一种偶联抗EpCAM抗体的免疫磁珠富集检测CTCs的方法
摘要：	本发明为一种偶联抗EpCAM抗体的免疫磁珠富集检测CTCs的方法：1、抗EpCAM单克隆抗体与磁珠偶联；2.制备循环肿瘤细胞样品：取免疫磁珠，加入生物肿瘤细胞样本中混匀，然后用磁力分离器分离，PBS清洗，将磁珠吸附细胞悬浮于PBS溶液中，进行细胞计数，使用细胞计数板检测富集到的细胞；将纳米免疫磁珠加入1ml人工肿瘤细胞血液样品中磁力分离，PBS清洗，然后将磁珠吸附细胞重新悬浮于PBS中；取5ul样品,滴加于载玻片上，使用抗EpCAM‑FICT,进行孵育，使用流式细胞仪对富集的细胞进行检测，肿瘤细胞‑荧光标记EpCAM鉴定有效性。在荧光倒置显微镜下进行计数，肿瘤细胞株细胞混入外周血后的富集、鉴定同上。极大地提高了循环肿瘤细胞检测的敏感性和特异性。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	江苏;32
申请人：	太仓极光克赛生物技术有限公司
发明人：	卢英
专利状态：	有效
申请日期：	2019-09-12T00:00:00+0800
发布日期：	2019-11-15T00:00:00+0800
申请号：	CN201910863841.8
公开号：	CN110456077A
代理机构：	北京科家知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：	陈娟
分类号：	G01N33/68(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	215400江苏省苏州市太仓市经济开发区北京西路6号
主权项：	1.一种偶联抗EpCAM抗体的免疫磁珠富集检测CTCs的方法，其特征在于，包括如下步骤： S1.抗体与磁珠偶联： 1)抗EpCAM单克隆抗体偶联前，在4℃下，经过三次透析，过夜，储存在PBS中，将浓度分别调整到5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L以及20μmol/L； 2)纳米免疫磁珠的制备：取四份活化的羧基磁珠300μL，浓度2mg/mL，分别加入40μL浓度为5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L、20μmol/L的抗EpCAM单克隆抗体，在1ml的离心管中，于室温下混合3h，用1ml的PBS清洗三次，加入300μL浓度为0.25mol/L甘氨酸混合25min，封闭剩余的醛基；再次用1ml的PBS清洗三次；加入含有质量百分比2.5％BSA的PBS溶液混合30min，封闭非特异性的吸附位点，之后用1ml的PBS清洗三次，加入300μL PBS缓冲液漩涡震荡，即得到浓度为2.0mg/ml的均匀的修饰有一抗的免疫磁珠； S2.制备循环肿瘤细胞样品： 1)实验室培养各种肿瘤细胞样本，取各种肿瘤细胞，100μL，加入1.5mL离心管中，肿瘤细胞于外周血中制成人工样本，每种细胞为三管； 2)取5μL上述制备好的各种肿瘤细胞与5mL健康人血液混合，每种细胞制备三管； 3)取适量免疫磁珠，加入100ul生物肿瘤细胞样本中混匀，然后用磁力分离器分离，PBS清洗，将磁珠吸附细胞悬浮于PBS溶液中，进行细胞计数，使用细胞计数板检测富集到的细胞； 4)将适量纳米免疫磁珠加入1ml人工肿瘤细胞血液样品中磁力分离，PBS清洗，然后将磁珠吸附细胞重新悬浮于PBS中；取5ul样品,滴加于载玻片上，使用抗EpCAM-FICT,进行孵育，使用流式细胞仪对富集的细胞进行检测，肿瘤细胞-荧光标记EpCAM鉴定有效性；在荧光倒置显微镜下进行计数，肿瘤细胞株细胞混入外周血后的富集、鉴定同上。 2.根据权利要求1所述的一种偶联抗EpCAM抗体的免疫磁珠富集检测CTCs的方法，其特征在于，所述纳米免疫磁珠的制备的反应条件为：反应介质为0.01M PBS，PH＝7.4，温度为室温，反应时间为3h，抗体和磁珠质量比为200μg：1000μg。 3.根据权利要求1所述的一种偶联抗EpCAM抗体的免疫磁珠富集检测CTCs的方法，其特征在于，所述肿瘤细胞为乳腺癌症(MCF-7)，食道癌(EC109)，非小细胞肺癌(A549)，子宫颈癌(Hela)，胃癌(NCI-N87)、结肠癌(HT29)。
所属类别：	发明专利