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原文传递一种循环肿瘤细胞的检测方法

专利名称：	一种循环肿瘤细胞的检测方法
摘要：	本发明涉及一种循环肿瘤细胞的检测方法：采集人体液样本，用甲醛固定后增加细胞膜通透性，将细胞加入若干组PCR多联管中，每管加有携带ID1的逆转录引物，逆转录成cDNA分子后，收集细胞混合加入另一组PCR多联管中，每管中加有携带ID2且3’端能够特异性识别cDNA分子的3’端的延伸引物，通过序列互补后进行延伸反应，收集并裂解细胞，通过PCR引物预扩增延伸产物。高通量测序，分析ID1:ID2的组合方式。其优点在于：同时对不同的标志物进行逆转录与PCR扩增，可准确识别循环肿瘤细胞、发生EMT的循环肿瘤细胞，并能联合其它技术使用，最大程度检测体液样本中极少的循环肿瘤细胞以及其它非体液稀有细胞。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	上海;31
申请人：	上海市第十人民医院
发明人：	孙奋勇;潘秋辉;江赐忠;吴棋;黄楠;崔中奇
专利状态：	有效
申请日期：	2018-05-07T00:00:00+0800
发布日期：	2019-11-15T00:00:00+0800
申请号：	CN201810425065.9
公开号：	CN110456034A
代理机构：	上海卓阳知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：	周春洪
分类号：	G01N33/50(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	200072上海市静安区延长中路301号
主权项：	1.一种对体液中的循环肿瘤细胞进行检测的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤： a.采集人体体液标本； b.收集体液中的有核细胞，对细胞进行固定，并处理细胞增加细胞膜通透性； c.将细胞均匀分散到一组PCR多联管中，每管中加有携带不同识别序列ID1的逆转录引物，逆转录得到cDNA分子，其5’端携带有特异性ID1序列； d.收集细胞混合加入另一组PCR多联管中，每管中加有携带不同识别序列ID2，且3’端能够特异性识别cDNA分子的3’端的延伸引物，通过序列互补后进行延伸反应； e.收集合并细胞，裂解细胞，10-15个循环PCR预扩增d中延伸产物； f.收集PCR预扩增产物并纯化； g.对PCR产物进行高通量测序； h.分析每个有效分子序列中ID1:ID2的组合方式，可以对循环肿瘤细胞以及其它非体液稀有细胞的准确数目进行评估。 2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述体液包括血液、尿液、胸腔积液、腹腔积液、脑脊液、消化液。 3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤b中固定细胞所用试剂选自戊二醛、甲醛、丙酮、甲醇、乙醇、醋酸、丙烯醛、醋酸铀、铬酸、苦味酸的任一种或其组合。 4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤b中增加膜通透性的试剂为非离子表面活性剂。 5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述非离子表面活性剂为Triton-X 100。 6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤c和/或步骤d中PCR多联管的数量为3个或3个以上。 7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤c中ID1包括2个或2个以上的核酸序列，通过排列组合成16种或16种以上的唯一识别序列，对应每个含有细胞的PCR管；步骤d中ID2包括2个或2个以上的核酸序列，通过排列组合成16种或16种以上的唯一识别序列，对应每个含有细胞的PCR管。 8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤c中ID1序列直接合成在逆转录引物序列上，或通过连接、延伸、互补配对的方式连接到逆转录后的cDNA分子上。 9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤d中ID2序列通过连接、延伸、互补配对或PCR扩增的方式连接到逆转录后的cDNA分子的互补链上。 10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤d中的特异性识别的标志物为上皮细胞的标志物、肿瘤特异性的标志物或间质细胞标志物。 11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述上皮细胞的标志物为CK18、CK19、EpCAM、KRT20、KRT19、KRT7、E-cadherin中的任一种或其组合；所述肿瘤特异性的标志物为CEA、SCC、CA125、CA50、CA19-9、CA242、CA724、CEA、CA125、ALP、AFP-L3、AFU、GP73、PSA、PCA3、TMPRSS2-ETS、PIVKA-II、NSE、CYFRA21-1、CEA、CA153、AFP中的任一种或其组合；所述间质细胞标志物为Vimentin、fibronectin、MMP9、N-cadherin、AKT2中的任一种或其组合。 12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法用于非疾病诊断或治疗用途。 13.一种用于检测循环肿瘤细胞的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：1)上皮细胞特异标志物的逆转录与扩增引物；2)肿瘤细胞特异标志物的逆转录与扩增引物；3)固定试剂与透膜试剂。 14.根据权利要求13所述的试剂盒，其特征在于，所述上皮细胞特异标志物的逆转录与扩增引物用于检测体液中的循环肿瘤细胞或其它非体液性稀有细胞。 15.根据权利要求13所述的试剂盒，其特征在于，所述肿瘤细胞特异标志物的逆转录与扩增引物用于检测体液中的循环肿瘤细胞。 16.根据权利要求13所述的试剂盒，其特征在于，所述固定试剂选自戊二醛、甲醛、丙酮、甲醇、乙醇、醋酸、丙烯醛、醋酸铀、铬酸、苦味酸中的任一种或其组合。 17.根据权利要求13所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括说明书，所述说明书中记载权利要求1～12中任一项的方法。 18.一种循环肿瘤细胞的检测系统，其特征在于，所述检测系统能够进行权利要求1～12任一项的方法，和/或能够使用权利要求13～17任一项的试剂盒处理待检测样品。 19.根据权利要求18所述的检测系统，其特征在于，所述检测系统是自动化系统。
所属类别：	发明专利