详情

原文传递一种淡水纤毛虫的定量蛋白银染色法

专利名称：	一种淡水纤毛虫的定量蛋白银染色法
摘要：	本发明提供一种淡水纤毛虫的定量蛋白银染色法，包括样品固定、过滤浓缩、琼脂包埋、琼脂固化、蛋白银染色和脱水封片，该发明染色效果较好、单位时间制片更多、整体染色效果均匀且易于封片，更加适合于中国典型富营养化湖泊浮游纤毛虫定性和定量研究的蛋白银染色技术。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	安徽;34
申请人：	安徽省农业科学院水产研究所
发明人：	李静;陈非洲;卢文轩;杨坤;方婷;梁阳阳;赵秀侠
专利状态：	有效
申请日期：	2019-08-05T00:00:00+0800
发布日期：	2019-11-12T00:00:00+0800
申请号：	CN201910716622.7
公开号：	CN110441117A
代理机构：	合肥东邦滋原专利代理事务所(普通合伙)
代理人：	王芸
分类号：	G01N1/30(2006.01);G;G01;G01N;G01N1
申请人地址：	230000安徽省合肥市庐阳区农科南路40号
主权项：	1.一种淡水纤毛虫的定量蛋白银染色法，其特征在于：包括以下步骤：步骤一：样品固定：用颜色固定液Bouin’s液固定原水样，终浓度5％(v/v)；步骤二：过滤浓缩：取适量步骤一中样品置于上覆硝酸纤维膜的过滤器中抽滤；步骤三：琼脂包埋：包括以下子步骤； (1)将步骤二中载有虫体且表面干燥的滤膜取出并置于持续保温的载玻片中心，另取一热载玻片滴加4％w/v液体琼脂后快速翻转、覆盖在第一片载玻片及滤膜上保持1min，以上步骤需在热度约60℃的加热板上操作完成； (2)将两载玻片连同其中琼脂包埋的滤膜一同转入盛有自来水的培养皿中冷却固化15min以上； (3)移去下面载玻片、去除多余琼脂并剥落、修剪滤膜，将滤膜集中放在自制滤膜框中；步骤四：琼脂固化：将滤膜放至10％甲醛溶液中浸泡9min，固化琼脂；开始可将两滤膜叠加同步进行，保持较好染色效果的同时将大大提高染色制片效率；步骤五：蛋白银染色：包括以下子步骤： (1)将滤膜从甲醛溶液中取出，用自来水浸泡至少10s； (2)将滤膜用0.2％高锰酸钾溶液漂白2min50s； (3)再次将滤膜自来水浸泡2次，每次1min； (4)将上述步骤中的滤膜用2.5％草酸还原2min50s； (5)将上述步骤中的滤膜自来水浸泡3次，蒸馏水浸泡1次，每次1min； (6)将上述步骤中的滤膜置于蛋白银溶液中，随后移至60度恒温箱中静置染色45min； (7)将上述步骤中的滤膜用显影液显影17s，至细胞变黄后将滤膜转到自来水中停止显影； (8)将上述步骤中的滤膜用自来水和蒸馏水各浸泡1min后，移至0.5％氯化金溶液浸泡3-4s； (9)将上述步骤中的滤膜放入2.5％草酸浸泡30s，在放入蒸馏水浸泡2min，随后放入2.5％硫代硫酸钠定影3min；最后用自来水浸泡4次，蒸馏水浸泡1次，每次3min；步骤六：脱水封片：上述滤膜依次经30％异丙醇中浸泡7min、50％异丙醇中浸泡7min、70％异丙醇中浸泡7min、100％异丙醇中浸泡两次且每次5min、异丙醇/二甲苯(1:1)混合液中浸泡5min、100％二甲苯中浸泡两次且每次7min后，将滤膜脱水并透明化，用中性树胶封片、六角螺母压片，放在干燥通风处自然晾干，保存备检。 2.根据权利要求1所述的一种淡水纤毛虫的定量蛋白银染色法，其特征在于：所述步骤二中硝酸纤维膜的尺寸为硝酸纤维膜孔径为0.45μm，步骤二中抽滤前加几滴蒸馏水使膜与滤器更加贴合、膜受压力更均匀，抽滤时压力小于0.02Mpa。 3.根据权利要求1所述的一种淡水纤毛虫的定量蛋白银染色法，其特征在于：所述步骤三中为使整张膜染色效果更加均匀，滤膜框尺寸在基础上将凹形结构模块下方两侧各裁去直角边长为10mm的等腰直角三角形。 4.根据权利要求1所述的一种淡水纤毛虫的定量蛋白银染色法，其特征在于：所述步骤五蛋白银溶液浓度根据产品而定，使用Fluka Silver proteinate，浓度以8g/L为宜，使用Sigma Protargol S，浓度为5g/L时即可取得较好染色效果，使用自制蛋白银粉末时，浓度需提高至12g/L以上才可满足需求。 5.根据权利要求1所述的一种淡水纤毛虫的定量蛋白银染色法，其特征在于：所述步骤五中的显影液需现用现配并严格按照药品顺序调制，依次为0.1％对苯二酚、0.5％亚硫酸钠和0.1％无水碳酸钠的合成溶液。 6.根据权利要求1所述的一种淡水纤毛虫的定量蛋白银染色法，其特征在于：所述步骤六中六角螺母以锡箔纸包裹，干燥通风时间为数周，期间需补胶。
所属类别：	发明专利